SDF-1-CXCR4信號(hào)通過(guò)ERK和PI3K-AKT信號(hào)通路上調(diào)survivin調(diào)節(jié)人骶骨軟骨肉瘤細(xì)胞周期和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、目的和意義:軟骨肉瘤是是目前最常見(jiàn)的原發(fā)惡性腫瘤之一，嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量，且早期診斷困難，治療方法單一。目前關(guān)于軟骨肉瘤，尤其是骶軟骨肉瘤的研究還十分匱乏，且主要集中在腫瘤的臨床分期及治療手段上，關(guān)于骶軟骨肉瘤的早期診斷，腫瘤的生物分子標(biāo)記，發(fā)病機(jī)理以及腫瘤的靶向治療方面的研究還很少，而這些恰恰是從源頭上治愈腫瘤，杜絕腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵問(wèn)題。因此本研究將從分子角度入手，著重關(guān)注CXCR4和Survivin兩個(gè)分子在軟骨肉瘤細(xì)胞EMT以及

2、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中的作用，通過(guò)CXCR4和Survivin將腫瘤發(fā)生過(guò)程的重要信號(hào)通路，包括EMT、MEK/ERK和PI3K/AKT通路以及細(xì)胞周期調(diào)控有機(jī)地結(jié)合在一起，初步探討了兩者在骶軟骨肉瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用，為骶軟骨肉瘤的早期診斷以及免疫治療提供了可能的靶點(diǎn)和新的可能的治療方法。
　　方法:隨機(jī)抽取來(lái)自2008年1月至2014年6月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院和山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診的30位患者的病理組織材料。首先對(duì)所有樣品材料進(jìn)

3、行切片和免疫組化，檢測(cè)指標(biāo)為CXCR4和Survivin在所有樣品中的表達(dá)情況，包括蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)位置以及其表達(dá)強(qiáng)度，然后采用回顧分析的方法，將CXCR4和Survivin的表達(dá)情況與各個(gè)樣本的臨床特征進(jìn)行對(duì)應(yīng)分析，從而得出CXCR4和Survivin的表達(dá)與各臨床特征之間的關(guān)系;隨后利用western blot和定量PCR分別檢測(cè)了不同濃度梯度和不同時(shí)間點(diǎn)SDF-1處理后，軟骨肉瘤細(xì)胞系SW1353細(xì)胞中Survivin蛋白質(zhì)和m

4、RNA的表達(dá)量的變化;使用激酶抑制劑分別阻斷SW1353細(xì)胞的MEK/ERK和PI3K/AKT通路，檢測(cè)SDF-1誘導(dǎo)的survivin蛋白表達(dá)水平的變化;接下來(lái)，我們利用survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細(xì)胞，來(lái)降低survivin的mRNA水平并進(jìn)一步降低survivin的蛋白表達(dá)，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)survivin降低后對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的影響;最后，利用Western blot檢測(cè)20 ng/ml SDF-1處理后，對(duì)照組

5、和survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細(xì)胞中Snail和N-cadherin的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:CXCR4蛋白主要在骶軟骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)部分表達(dá)，Survivin蛋白主要定位于骶軟骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，兩者在亞細(xì)胞定位上具有一定的空間重疊。
　　30位患者及其各自的CXCR4和Survivin表達(dá)情況與臨床特征統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，Survivin蛋白的在骶軟骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為87.6％(2

6、6/30)，CXCR4在骶軟骨肉瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為83.3％(25/30)。另外，在高分化骶軟骨肉瘤患者中，CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)比例為73％，在重度骶軟骨肉瘤患者中，CXCR4的陽(yáng)性表達(dá)比例為84％;同時(shí)，在輕度患者中，Survivin蛋白的陽(yáng)性表達(dá)比例為73％，中重度患者為84％，CXCR4和Survivin蛋白表達(dá)情況高度一致。更重要的是，Western結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXCR4和Survivin在重度骶軟骨肉瘤組織中的表達(dá)水平顯著高于

7、輕度組織，表明CXCR4和Survivin和骶軟骨肉瘤的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。CXCR4和Survivin的表達(dá)與骶軟骨肉瘤的嚴(yán)重程度有關(guān)。在中重度骶軟骨肉瘤（Ⅱ，Ⅲ級(jí)）組織內(nèi)，CXCR4陽(yáng)性比例為100％(16/16)，而在輕度組織內(nèi)，CXCR4陽(yáng)性比例為64.3％(9/14)。正如預(yù)期的那樣，Survivin在中重度骶軟骨肉瘤（Ⅱ，Ⅲ級(jí)）和輕度（Ⅰ級(jí)）組織內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)比例分別為100％(16/16)和71.4％(10/14)。與輕度骶軟骨

8、肉瘤相比，中重度骶軟骨肉瘤組織的CXCR4和Survivin表達(dá)比例顯著升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。另外，我們也統(tǒng)計(jì)了CXCR4和Survivin與骶軟骨肉瘤復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。在所有復(fù)發(fā)病例中，CXCR4和Survivin的陽(yáng)性表達(dá)比例均為100％(15/15)。在未發(fā)生復(fù)發(fā)的病例中，CXCR4陽(yáng)性表達(dá)比例為67％(10/15)，Survivin的陽(yáng)性表達(dá)比例為73％(11/15)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示CXCR4(P=0.014)和Su

9、rvivin(P=0.032)的表達(dá)在復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)病例中所占比例有顯著差異，其與骶軟骨肉瘤復(fù)發(fā)之間直接相關(guān)。western blot結(jié)果顯示隨著SDF-1蛋白處理濃度的提高，由0升高到10，20ng/ml，Survivin蛋白的表達(dá)也隨之升高，但50ng/ml和20ng/ml SDF-1處理后Survivin表達(dá)量沒(méi)有顯著差異，表明當(dāng)SDF-1達(dá)到20ng/ml時(shí)其對(duì)Survivin蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)作用即達(dá)到飽和，所以除非另有說(shuō)明，以后的

10、SDF-1體外處理濃度都選用20ng/ml。體外使用20ng/ml SDF-1處理SW1353細(xì)胞，分別在處理0，2，4，8，12，和36小時(shí)后取材進(jìn)行Western檢測(cè)。結(jié)果表明，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，0，2，4，8小時(shí)處理后，Survivin蛋白的表達(dá)量逐漸升高，但處理8，12，36小時(shí)后Survivin蛋白表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，表明20ng/ml SDF-1處理8h后，其對(duì)Survivin蛋白的誘導(dǎo)作用即達(dá)到飽和。以上結(jié)果說(shuō)明SDF-

11、1對(duì)Survivin的誘導(dǎo)作用是劑量和時(shí)間依賴(lài)性的。定量PCR顯示SDF-1誘導(dǎo)后Survivin mRNA也表現(xiàn)出類(lèi)似的結(jié)果。在研究SDF-1對(duì)survivin的上調(diào)作用是否依賴(lài)于MEK/ERK和PI3K/AKT通路的試驗(yàn)中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與DMSO處理對(duì)照組相比，U0126(P=0.024)和LY294002(P=0.0293)可以顯著降低SW1353細(xì)胞中SDF-1對(duì)survivin蛋白的誘導(dǎo)水平。這表明在體外細(xì)胞試驗(yàn)中SDF-1對(duì)s

12、urvivin蛋白的誘導(dǎo)作用是依賴(lài)于MEK/ERK和PI3K/AKT途徑的。隨后構(gòu)建了survivinsiRNA轉(zhuǎn)染的SW1353細(xì)胞系，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)的survivin蛋白水平顯著下降。與對(duì)照組相比，siRNA轉(zhuǎn)染誘導(dǎo)survivin表達(dá)水平降低后，可以顯著抑制細(xì)胞周期蛋白D1及CDK2的表達(dá)，表明survivin可以影響細(xì)胞周期進(jìn)程。我們進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)對(duì)照組和轉(zhuǎn)染后細(xì)胞所處細(xì)胞周期比例進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與單獨(dú)使用SDF-1處

13、理和對(duì)照組相比，survivin siRNA顯著降低了SW1353細(xì)胞中S期細(xì)胞所占比例。處理24h后，與對(duì)照組的23.5％相比，survivin siRNA轉(zhuǎn)染組的S細(xì)胞只占總細(xì)胞數(shù)的6.2％(Df=2，x2=6.73，0.01＜P＜0.05)。為了確定SDF-1對(duì)survivin的誘導(dǎo)作用是否對(duì)EMT產(chǎn)生影響，我們檢測(cè)了20 ng/mlSDF-1處理后，對(duì)照組和survivin siRNA轉(zhuǎn)染SW1353細(xì)胞中Snail和N-cad

14、herin的表達(dá)水平。
　　結(jié)論:首先利用免疫組化的方法證明了CXCR4蛋白主要在骶軟骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)部分表達(dá)，Survivin蛋白主要定位于骶軟骨肉瘤細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，且CXCR4和Survivin蛋白在骶軟骨肉瘤組織細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)性表達(dá)率很高，另外兩者的表達(dá)和骶軟骨肉瘤的嚴(yán)重程度，復(fù)發(fā)情況有非常顯著的對(duì)應(yīng)關(guān)系，與年齡、性別差異無(wú)關(guān)，因此CXCR4和Survivin蛋白的高表達(dá)有可能可以作為骶軟骨肉瘤的生物分子標(biāo)記應(yīng)

15、用于骶軟骨肉瘤的早期檢測(cè)。western blot和定量PCR結(jié)果顯示隨著SDF-1蛋白處理濃度的提高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，Survivin的蛋白和mRNA表達(dá)也隨之升高。表明Survivin的蛋白和mRNA水平都受到SDF-1/CXCR4的活性的影響。說(shuō)明SDF-1/CXCR4在Survivin的上游發(fā)揮作用，由SDF-1/CXCR4激活的某些組分可以在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)Survivin的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，這就將SDF-1/CXCR4通路

16、和Survivin聯(lián)接到了一起，同時(shí)也證明了由SDF-1/CXCR4調(diào)控的腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲和由Survivin調(diào)控的細(xì)胞周期之間是相互聯(lián)系，相互影響的。MEK/ERK和PI3K/AKT通路抑制劑處理的實(shí)驗(yàn)證明了MEK/ERK和PI3K/AKT參與了SDF-1/CXCR4對(duì)Survivin的調(diào)節(jié)作用。我們的研究還證明使用siRNA抑制SW1353細(xì)胞的Survivin表達(dá)后，可以顯著影響細(xì)胞的細(xì)胞周期，顯著減少SW1353細(xì)胞G2/M期

17、的比例。而同時(shí)Survivin siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞顯著抑制了SDF-1誘導(dǎo)的Snail和N-cadherin的表達(dá)。而Snail和N-cadherin作為EMT的分子標(biāo)記，其表達(dá)下降表明Survivin蛋白的缺失可以抑制軟骨肉瘤的EMT，即SDF-1/CXCR4誘導(dǎo)的細(xì)胞EMT是依賴(lài)于Survivin蛋白的。SDF-1/CXCR4與Survivin蛋白之間的相互作用表明EMT和細(xì)胞周期是一個(gè)相互影響的過(guò)程，兩個(gè)過(guò)程間可以互相協(xié)調(diào)，相互影