Beagle犬脂肪干細(xì)胞向類髓核細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、現(xiàn)代社會(huì),隨著人口老齡化的不斷增加及生活、工作壓力的不斷加大,越來越多的人出現(xiàn)腰腿痛的癥狀,且具有年輕化的趨勢(shì),研究表明腰椎間盤退行性疾病(degenerative disc disease,DDD)是引起腰腿痛的主要病因之一。DDD不僅嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,而且給患者家庭及社會(huì)帶來了巨大的醫(yī)療經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為椎間盤的退變?cè)从谒韬?髓核細(xì)胞凋亡、功能下降,功能性細(xì)胞外基質(zhì)合成減少。目前常規(guī)的治療方式都不能從根本上延緩或修復(fù)

2、椎間盤的退變,遠(yuǎn)期治療效果也不理想。近年來隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及組織工程學(xué)技術(shù)的進(jìn)步,生物學(xué)治療技術(shù)成為各領(lǐng)域研究的焦點(diǎn),其中利用種子細(xì)胞移植或組織工程髓核的方法來修復(fù)已退變的椎間盤成為新的探索熱點(diǎn)。種子細(xì)胞移植治療及細(xì)胞活性研究是生物學(xué)治療方法研究的基礎(chǔ);組織工程髓核技術(shù)研究的首要問題、基本問題同樣是篩選一種最為合適的種子細(xì)胞,然后再聯(lián)合應(yīng)用生物支架材料、細(xì)胞因子等等。截至目前,已研究的種子細(xì)胞有很多種,其中脂肪干細(xì)胞(adipose

3、 derived stem cells,ADSCs)由于具有取材方便、對(duì)機(jī)體的創(chuàng)傷小、增殖能力強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn),已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種組織的再生研究,包括椎間盤退變的修復(fù)研究。很多實(shí)驗(yàn)也證實(shí)ADSCs的移植可以延緩椎間盤的退變,ADSCs與髓核細(xì)胞共培養(yǎng)可誘導(dǎo)ADSCs分化為類髓核細(xì)胞,其原理可能就是通過髓核細(xì)胞分泌的多種生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)等對(duì)ADSCs起作用的。目前

4、采用Beagle犬ADSCs在椎間盤退變修復(fù)研究中的應(yīng)用較少,體外聯(lián)合應(yīng)用兩種細(xì)胞生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ADSCs分化為類髓核細(xì)胞的報(bào)道尚少見。
　　基于以往種子細(xì)胞移植及組織工程髓核方面的各項(xiàng)研究基礎(chǔ),我們將選取Beagle犬ADSCs作為種子細(xì)胞研究對(duì)象,聯(lián)合使用TGF-β1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP-7)兩種生物活性因子作為誘導(dǎo)環(huán)境因素,將細(xì)胞接種至該誘導(dǎo)環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng),研究該誘

5、導(dǎo)液對(duì)ADSCs增殖情況的影響,探討B(tài)eagle犬ADSCs向類髓核細(xì)胞分化的情況,對(duì)ADSCs作為種子細(xì)胞移植治療椎間盤退行性疾病的探索和研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為髓核組織工程體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　目的:觀察體外分離、培養(yǎng)的Beagle犬ADSCs,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞免疫表型;研究含有TGF-β1、BMP-7的誘導(dǎo)液對(duì)ADSCs增殖及其形態(tài)情況的影響,探討聯(lián)合應(yīng)用TGFβ-1、BMP-7兩種生長(zhǎng)因子能否誘導(dǎo)ADSCs向類髓核細(xì)

6、胞分化,證實(shí)ADSCs可作為種子細(xì)胞,為椎間盤退變的細(xì)胞移植治療及組織工程髓核研究提供理論依據(jù)。
　　方法:無菌手術(shù)切取Beagle犬腹股溝處脂肪組織,采用I型膠原酶消化法與細(xì)胞貼壁法提取、分離、培養(yǎng)ADSCs,待細(xì)胞融合至80％時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)特征及生長(zhǎng)狀態(tài);細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)定第3代ADSCs增殖能力,繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代細(xì)胞表面抗原:CD34、CD45、CD73、CD105、HLA-D

7、R、HLA-ABC。取生物學(xué)性能穩(wěn)定細(xì)胞進(jìn)行體外單層誘導(dǎo)培養(yǎng),以細(xì)胞密度為1×105/ml接種至普通6孔培養(yǎng)板,分實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組用含有TGF-β1和BMP-7培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),對(duì)照組采用普通培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),同時(shí)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài);采用CCK-8法對(duì)兩組細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行檢測(cè)比較;在培養(yǎng)后的第7、14天,提取細(xì)胞總RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用RealTime-PCR法檢測(cè)兩組細(xì)胞I型膠原、II型膠原、蛋白多糖的基因相

8、對(duì)表達(dá)情況。
　　結(jié)果:原代細(xì)胞培養(yǎng)第2-3天可見部分細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞形態(tài)為橢圓形或短梭形,第6-7天觀察細(xì)胞開始形成集落,呈典型的長(zhǎng)梭形,第10天細(xì)胞呈漩渦狀生長(zhǎng),細(xì)胞融合率80%左右。第3代ADSCs生長(zhǎng)曲線呈“S”型,第1-3天細(xì)胞增殖速度較慢,第4-7天細(xì)胞呈對(duì)數(shù)增殖,第8天后細(xì)胞鋪滿平底,生長(zhǎng)開始進(jìn)入平臺(tái)期。流式細(xì)胞分析檢測(cè)細(xì)胞免疫表型結(jié)果:ADSCs表達(dá)CD73、CD105、HLA-ABC陽性,表達(dá)CD34、CD45

9、、HLA-DR陰性。誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后,倒置相差顯微鏡觀察見細(xì)胞形態(tài)開始變?yōu)槎趟笮?、多角?CCK-8法檢測(cè)結(jié)果提示在誘導(dǎo)微環(huán)境中培養(yǎng)的細(xì)胞增殖速度略低于普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的增殖速度。RealTime-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞Ⅱ型膠原和蛋白多糖基因的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;然而I型膠原基因的相對(duì)表達(dá)量,兩組之間無明顯差別(P>0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;體外誘導(dǎo)培養(yǎng)14天,

10、實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞II型膠原基因的相對(duì)表達(dá)量仍高于對(duì)照組(P<0.05),但低于誘導(dǎo)培養(yǎng)7天時(shí),此時(shí)I型膠原、蛋白多糖基因的相對(duì)表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:通過I型膠原酶消化法和細(xì)胞貼壁分離法能夠成功從Beagle犬腹股溝處脂肪組織中提取分離出ADSCs,其增殖能力強(qiáng),生物學(xué)性能穩(wěn)定;流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)細(xì)胞免疫表型提示細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫表型,不表達(dá)造血干細(xì)胞免疫表型。含有TGF-β1、BMP-7的誘導(dǎo)培養(yǎng)液對(duì)ADSCs的增殖有