長(zhǎng)鏈非編碼RNA-HRIM通過(guò)自噬通路調(diào)控心肌缺血再灌注損傷的初步研究.pdf

1、背景：冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。┦切难茏畛Ｒ?jiàn)疾病，急性心肌梗死是人類致死的主要原因之一。再灌注治療可以挽救瀕臨死亡的心肌，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致另一種損傷---缺血再灌注損傷。如何心肌缺血再灌注損傷程度，改善病人的預(yù)后已成為當(dāng)前心血管疾病領(lǐng)域的一個(gè)重要課題。缺血再灌注造成心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制尚未完全闡明。一般認(rèn)為，在心肌缺血再灌注損傷中導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡的形式只有凋亡和壞死兩種形式，近年研究證實(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)存在第三種機(jī)制調(diào)控心肌細(xì)胞的存活或死

2、亡，即自噬作用。它與凋亡類似，通過(guò)啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)部信號(hào)通路，形成級(jí)聯(lián)式信息傳導(dǎo)和相應(yīng)基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。最近的研究顯示異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNAs，lncRNAs)在多種疾病過(guò)程中扮演著重要的角色，這為心肌缺血再灌注機(jī)制的研究又增添了一個(gè)切入點(diǎn)。
　　目的：分析心肌缺血再灌注過(guò)程中差異性表達(dá)的lncRNAs，尋找與心肌缺血再灌注損傷相關(guān)的lncRNAs，探討lncRNA調(diào)控心肌缺血再灌注的機(jī)制

3、并為心肌缺血再灌注損傷的治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　第一部分:lncRNAs在心肌缺血再灌注中的差異性表達(dá)及目的lncRNAs的挑選利用心肌細(xì)胞經(jīng)過(guò)缺氧再?gòu)?fù)氧處理模擬臨床上心肌缺血再灌注損傷后做基因芯片，建立心肌缺血再灌注過(guò)程中差異性表達(dá)的lncRNAs譜和mRNAs譜（差異倍數(shù)＞1.5倍，P＜0.05）。我們利用一系列的生物信息學(xué)分析包括GO分析，Pathway分析針對(duì)心肌缺血再灌注損傷的機(jī)制確定研究方向，由于ln

4、cRNAs存在多種調(diào)控方式，因此根據(jù)lncRNAs通過(guò)調(diào)節(jié)mRNAs的表達(dá)發(fā)揮作用，對(duì)lncNRA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)lncRNAs可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白發(fā)揮相應(yīng)的作用，我們構(gòu)建lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，從而最終確定目的lncRNAs。
　　第二部分:lncRNAs-HRIM對(duì)心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧損傷影響的研究構(gòu)建體外心肌細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧模型（細(xì)胞水平）和langendorff離體心臟缺血再灌注模型（整體水平），采用qRT-

5、PCR檢測(cè)目的基因lncRNAs的表達(dá)情況。用RNAi技術(shù)對(duì)lncRNAs-HRIM進(jìn)行干擾，觀察lncRNAs對(duì)細(xì)胞活性的影響，利用Western blot檢測(cè)自噬蛋白LC3B的表達(dá)，透射電鏡觀察細(xì)胞自噬小體的數(shù)目，觀察自噬活性的改變情況以及采用自噬雙標(biāo)腺病毒(mRFP-GFP-LC3)追蹤自噬流。
　　結(jié)果：
　　第一部分:基因芯片結(jié)果顯示常氧組心肌細(xì)胞和缺氧再?gòu)?fù)氧組心肌細(xì)胞之間存在大量差異表達(dá)的基因，包括797條lnc

6、RNAs和1898條mRNAs。其中許多與低氧或自噬相關(guān)的分子均高表達(dá)。一系列的生物信息學(xué)分析包括GO分析、pathway分析、trans/cis靶基因預(yù)測(cè)以及l(fā)ncRNAs與mRNAs共表達(dá)分析提示心肌缺氧再?gòu)?fù)氧過(guò)程與細(xì)胞凋亡和自噬有關(guān)，并從中挑取6條表達(dá)上調(diào)的lncRNAs(NR_002154;lnc-RNA1，lnc-RNA2，lnc-RNA3，lnc-RNA4，lnc-RNA5)和2條表達(dá)下調(diào)的lncRNAs(lnc-RNA6，

7、lnc-RNA7)，并將其中一條表達(dá)上調(diào)的lncRNA-NR_002154定義為心肌缺氧再?gòu)?fù)氧損傷相關(guān)的lncRNA(LncRNAAssociated with Hypoxia Reoxygenation Injury in Myocardial cell,lcnRNA-HRIM)。
　　第二部分:從細(xì)胞水平和整體水平，通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6條lncRNAs(NR_002154; lnc-RNA1，lnc-RNA2，ln

8、c-RNA3，lnc-RNA4，lnc-RNA5)表達(dá)發(fā)生下調(diào)和2條lncRNAs(lnc-RNA6，lnc-RNA7)表達(dá)發(fā)生下調(diào)，與基因芯片結(jié)果相符。RNAi結(jié)果顯示，在心肌細(xì)胞中缺氧再?gòu)?fù)氧過(guò)程中，隨著lncRNA-HRIM的表達(dá)的降低，細(xì)胞活性明顯增加，自噬的活性下降。
　　結(jié)論：
　　1.心肌在缺氧再?gòu)?fù)氧過(guò)程中具有特異的lncRNAs表達(dá)譜。
　　2.lncRNA-HRIM在心肌缺血再灌注損傷中參加自噬通路的調(diào)