E-鈣粘蛋白基因啟動子區(qū)高甲基化與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病風險關(guān)系的研究.pdf

1、目的:子宮內(nèi)膜異位癥是好發(fā)于育齡期婦女的一種婦科常見疾病，臨床癥狀主要表現(xiàn)為明顯的痛經(jīng)、月經(jīng)增多及不孕等，嚴重的影響了患者的生活質(zhì)量。目前，其發(fā)病機制仍不明確。子宮內(nèi)膜異位癥的惡變率很低，但是臨床研究顯示，其可以表現(xiàn)出侵襲轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤的特性。因此，介導侵襲轉(zhuǎn)移的基因可能在其發(fā)病過程中起到了重要的作用。
　　E-鈣粘蛋白，是一種跨膜糖蛋白，在細胞間的粘附過程中起重要作用，其表達水平的下調(diào)可導致細胞間的粘附能力降低，而細胞的活動性也

2、將隨之增加。在上皮性腫瘤中，E-鈣粘蛋白的表達下降可以直接促進細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲?；騿幼訁^(qū)的高甲基化是E-鈣粘蛋白下調(diào)甚至失活的重要途徑，在諸多腫瘤組織中都檢測到其基因CDH1啟動子區(qū)的高甲基化，并且mRNA和蛋白的表達量也會隨之下降。對于子宮內(nèi)膜異位癥的研究發(fā)現(xiàn)，在E-鈣粘蛋白表達下調(diào)的異位子宮內(nèi)膜細胞株中檢測到CDH1基因啟動子區(qū)的高甲基化，應用曲古抑菌素A（去甲基化藥物）處理后，E-鈣粘蛋白恢復高表達，同時細胞的侵襲性減弱。

3、r>　　本研究旨在探討CDH1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)在卵巢子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中的作用，意義在于從分子機制上更為深入地探究其發(fā)病機制，也為臨床上治療該疾病提供新的靶點。
　　方法:
　　1標本采集:病例組:2012.8-2013.3在河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦科就診并行手術(shù)治療的卵巢子宮內(nèi)膜異位癥（卵巢巧克力囊腫）患者的異位內(nèi)膜及其在位內(nèi)膜組織各50例，患者的平均年齡為36.74±6.76歲，術(shù)后病理診斷全部是子宮內(nèi)膜異位癥，術(shù)前

4、從未接受過激素治療。對照組:收集在同一家醫(yī)院同期因CINⅢ做全子宮切除術(shù)患者的子宮內(nèi)膜組織50例，患者的平均年齡為43.57±5.02歲，均經(jīng)病理證實是正常子宮內(nèi)膜組織，無惡變及子宮內(nèi)膜異位癥。
　　2實驗步驟
　　2.1標本處理:病例組與對照組標本離體后，即刻浸泡在事先準備好的RNA later液中，并馬上轉(zhuǎn)移到4℃冰箱中過夜，后放在-20℃冰箱中貯存以備用。
　　2.2 DNA提取:將病例組與對照組標本各取出50-

5、100mg，分別進行組織研磨，提取組織DNA。
　　2.3 E-鈣粘蛋白基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)檢測:利用甲基化特異性PCR技術(shù)(MSP)檢測所有標本的組織DNA中的甲基化情況，分別計算兩組的甲基化率。
　　2.4 MSP結(jié)果驗證:隨機抽取甲基化陽性和陰性樣本，PCR產(chǎn)物進行克隆和測序，驗證MSP結(jié)果的準確性。
　　2.5 RNA提取:將病例組與對照組標本各取出50-100mg，在冰上研磨，提取組織RNA。
　　2

6、.6 E-鈣粘蛋白基因mRNA表達水平的檢測:利用RT-PCR方法分別檢測甲基化陽性和甲基化陰性的標本中E-鈣粘蛋白基因mRNA的表達情況。
　　2.7 E-鈣粘蛋白表達水平的檢測:應用流式細胞術(shù)分別檢測甲基化陽性和甲基化陰性的標本中E-鈣粘蛋白的表達情況。
　　2.8數(shù)據(jù)分析:實驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件分析。
　　結(jié)果:
　　1病例組與對照組中CDH1基因啟動子區(qū)的甲基化情況
　　異位、在位和正常內(nèi)膜組織中，

7、CDH1基因的甲基化率分別是32％(16/50)、26％(13/50)和8％(4/50)。與正常內(nèi)膜組織相比，異位內(nèi)膜和在位內(nèi)膜組織中的甲基化率均明顯升高（x2=9.00，P=0.003;x2=5.74，P=0.017）。在位內(nèi)膜組織與異位內(nèi)膜組織相比，無明顯差異(x2=0.44，P=0.509)。
　　2甲基化陽性和甲基化陰性的組織中CDH1基因mRNA表達量的比較
　　甲基化陽性的組織中，CDH1基因mRNA的平均表達量

8、為0.41±0.20;甲基化陰性的組織中，CDH1基因mRNA的平均表達量為0.55±0.07。經(jīng)t檢驗方法統(tǒng)計，甲基化陽性組織中mRNA的表達量明顯低于甲基化陰性組織(t=-2.50，P=0.023)。
　　3甲基化陽性和甲基化陰性的組織中E-鈣粘蛋白表達量的比較
　　甲基化陽性組織中，E-鈣粘蛋白的平均表達率為9.58±8.08％;甲基化陰性的組織中，E-鈣粘蛋白的平均表達率為18.72±12.70％。經(jīng)t檢驗方法統(tǒng)計，

9、甲基化陽性組織中E-鈣粘蛋白的表達率明顯低于甲基化陰性組織(t=-2.35，P=0.027)。
　　4甲基化陽性和甲基化陰性的組織中CDH1基因mRNA表達量和E-鈣粘蛋白表達率的相關(guān)性比較
　　經(jīng)Pearson Correlation Coefficients檢驗方法統(tǒng)計，CDH1基因mRNA的表達量和其對應的E-鈣粘蛋白的表達率密切相關(guān)（r=0.43，P=0.017）。
　　結(jié)論:
　　卵巢子宮內(nèi)膜異位癥患者