mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在再生障礙性貧血中T淋巴細(xì)胞中的改變及影響因素.pdf

1、目的:
　　(1)探討mTOR信號(hào)通路在再生障礙性貧血T淋巴細(xì)胞中是否激活以及雷帕霉素(RAPA)和CTLA-4免疫球蛋白(CTLA-4Ig)對(duì)該信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中各分子及上、下游負(fù)性調(diào)控因子表達(dá)水平的影響。
　　(2)豐富AA中T淋巴細(xì)胞活化機(jī)制,探討RAPA及CTLA-4免疫球蛋白對(duì)再障T淋巴細(xì)胞mTOR通路的調(diào)控作用,尋找AA免疫抑制治療(IST)的新靶點(diǎn)。
　　方法:
　　(1)流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)3

2、7例AA患者外周血CD3+T淋巴細(xì)胞中磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化TSC(p-TSC)、磷酸化P70S6K(p-P70S6K)、磷酸化S6(p-S6)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、Sirt1表達(dá)水平。同時(shí)以17例體檢者外周血為正常對(duì)照組、急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(CEM)作為陽(yáng)性對(duì)照組。
　　(2)取患者外周血及CEM進(jìn)行體外培養(yǎng),分別加入RAPA和CTLA-4Ig孵育24小時(shí)和72

3、小時(shí),再用FCM檢測(cè)CD3+T淋巴細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR、p-TSC、P70S6K、p-S6、p-4EBP1、Sirt1表達(dá)水平。以 CEM作為陽(yáng)性對(duì)照組,根據(jù)RAPA和CTLA-4Ig作用前后上述因子表達(dá)水平的變化,評(píng)價(jià)這兩種藥物對(duì)AA患者mTOR途徑及其上下游負(fù)性調(diào)控因子的影響。
　　(3)實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定30例AA患者GAS5的表達(dá),與20例志愿者為正常對(duì)照、急性T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞株(CEM)陽(yáng)性對(duì)照相比較。<

4、br>　　(4)取30例AA患者骨髓及CEM進(jìn)行體外培養(yǎng),分別加入RAPA和CTLA-4Ig孵育24小時(shí)和72小時(shí)后,實(shí)時(shí)定量PCR法測(cè)定AA患者及CEM的GAS5表達(dá)。以CEM為陽(yáng)性對(duì)照,評(píng)價(jià)這兩種藥物對(duì)AA患者mTOR途徑負(fù)性調(diào)控因子GAS5的影響。
　　(5)比較AA組與正常對(duì)照組、CEM組RAPA、CTLA4-Ig作用前后p-Akt、p-mTOR、p-TSC、P70S6K、p-S6、p-4EBP1、Sirt1的表達(dá)量變化,

5、討論AA患者T淋巴細(xì)胞mTOR信號(hào)通路是否激活、藥物對(duì)其的調(diào)控作用,以及各組間Sirt1/p-Akt、Sirt1/p-TSC、Sirt1/p-mTOR、Sirt1/p-4EBP1、Sirt1/p-P70S6K及Sirt1/p-S6之間的差異。
　　結(jié)果:
　　(1)AA組CD3+T淋巴細(xì)胞中,mTOR途徑各磷酸化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(1.86

6、±1.51)、(2.21±0.21)、(1.64±1.28)、(1.44±0.31)、(1.63±1.04)、(8.11±3.89);正常對(duì)照組中為:(1.11±0.35)、(1.60±0.86)、(1.11±0.35)、(1.12±0.59)、(1.01±0.23)、(1.32±0.87);與正常對(duì)照組相比,AA組mTOR途徑中各磷酸化分子表達(dá)水平顯著升高,P均<0.05;mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt1、GAS5的表達(dá)水平分別為

7、:(0.98±0.07)、(2.83±1.52)明顯低于正常對(duì)照組(1.68±0.32)、(12.43±4.50),P均<0.05。
　　(2)RAPA孵育后AA組CD3+T淋巴細(xì)胞中:mTOR途徑各磷酸化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(1.07±0.16)、(1.75±0.59)、(0.95±0.31)、(1.10±0.27)、(1.00±0.13)、(5

8、.10±3.44),均較孵育顯著下降,P均<0.05。RAPA孵育后AA組mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt1、GAS5的表達(dá)水平分別為:(1.48±0.81)、(4.12±2.11),與孵育前相比,RAPA孵育后AA組中GAS5的表達(dá)水平明顯升高,P<0.05;兩組間Sirt1表達(dá)水平無(wú)明顯差異,P=0.149,但RAPA孵育后AA組中Sirt1/p-Akt、Sirt1/p-TSC、Sirt1/p-mTOR、Sirt1/p-4EBP1

9、、Sirt1/p-P70S6K及Sirt1/p-S6的值顯著高于孵育前,P<0.05。
　　(3)CTLA-4Ig孵育后AA組CD3+T淋巴細(xì)胞中:mTOR途徑各磷酸化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(1.01±0.36)、(1.59±0.72)、(0.80±0.44)、(1.01±0.31)、(0.99±0.41)、(3.91±2.86);與孵育前相比,RA

10、PA孵育后AA組mTOR途徑中各磷酸化分子表達(dá)水平顯著下降,P均<0.05。CTLA-4Ig孵育后AA組mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt1、GAS5的表達(dá)水平分別為:(1.31±0.50)、(4.45±0.52);正常對(duì)照組為:(1.68±0.32)、(12.43±4.50);與孵育前相比,CTLA-4Ig孵育后AA組中Sirt1、GAS5的表達(dá)水平明顯升高,P<0.05。
　　(4)陽(yáng)性對(duì)照組CEM細(xì)胞株中,mTOR途徑各磷酸

11、化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(3.45±1.23)、(5.61±2.11)、(3.68±1.67)、(3.85±1.41)、(3.67±1.35)、(13.12±5.31);與AA組相比,CEM組mTOR途徑中各磷酸化分子表達(dá)水平顯著升高,P<0.05;CEM細(xì)胞株mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt1、GAS5的表達(dá)水平分別為:(0.98±0.16)、(1.2

12、3±0.68)低于AA組及正常對(duì)照組,P均<0.05;RAPA孵育后CEM細(xì)胞株,mTOR途徑各磷酸化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(1.02±0.26)、(4.21±1.36)、(1.98±0.41)、(2.85±1.12)、(1.89±1.11)、(3.3±1.51),較孵育前顯著下降,P<0.05,RAPA孵育CEM細(xì)胞株組mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt

13、1、GAS5的表達(dá)水平分別為:(1.14±0.23)、(2.33±0.78),高于孵育前,P<0.05;CTLA-4Ig孵育后CEM細(xì)胞株,mTOR途徑各磷酸化分子:p-Akt、p-TSC、p-mTOR、p-P70S6K、p-S6、p-4EBP1的表達(dá)水平分別為:(0.99±0.32)、(4.63±2.31)、(1.86±0.23)、(2.67±1.34)、(2.36±1.45)、(2.48±1.32)均顯著低于孵育前,P<0.05,R

14、APA孵育CEM細(xì)胞株組mTOR途徑負(fù)性調(diào)節(jié)因子:Sirt1、GAS5的表達(dá)水平分別為:(2.11±0.36)、(2.11±1.01)高于孵育前,P<0.05。
　　結(jié)論:
　　(1)AA組CD3+T淋巴細(xì)胞mTOR途徑各磷酸化蛋白表達(dá)水平均明顯增高,上游負(fù)性調(diào)節(jié)因子Sirt1及下游GAS5表達(dá)不足,提示AA組中mTOR途徑處于相對(duì)活化狀態(tài)可能參與AA組T淋巴細(xì)胞的活化,且其活化狀態(tài)與負(fù)調(diào)控因素不足有關(guān)。
　　(2)R