Her2-neu基因沉默對(duì)腦膜瘤細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　1.搜集人腦膜瘤術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行原代培養(yǎng)并鑒定。
　　2.Her2 siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染人腦膜瘤細(xì)胞,觀察轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的增殖活性和生物學(xué)行為的改變。
　　方法:
　　1.在神經(jīng)外科術(shù)后搜集新鮮的腦膜瘤組織,經(jīng)過原代和傳代培養(yǎng)后獲得的腦膜瘤細(xì)胞,在對(duì)數(shù)生長期用免疫組化法和FISH法對(duì)其進(jìn)行鑒定。
　　2.將Her2 siRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染到人腦膜瘤細(xì)胞中,倒置顯微鏡在1-4天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察病毒的表達(dá)

2、,確定最佳感染復(fù)數(shù)(MOI)。
　　3.實(shí)驗(yàn)分為三組:①Control組:用含10-15％血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人的腦膜瘤細(xì)胞;②Mock組:感染空載體的腦膜瘤細(xì)胞;③Her2 siRNA組:感染了Her2 siRNA慢病毒的腦膜瘤細(xì)胞。
　　4.慢病毒感染72小時(shí)后,用CCK-8法檢測各組腦膜瘤細(xì)胞的增殖抑制率;同時(shí)應(yīng)用RT-PCR法檢測Her2/neu基因的表達(dá)情況;Western blot法檢測Her2、VEGF和K

3、i-67蛋白的表達(dá)情況。
　　5.將各組細(xì)胞接種至裸鼠腋下檢測成瘤情況。
　　結(jié)果:
　　1.搜集新鮮的人腦膜瘤術(shù)后標(biāo)本,進(jìn)行原代培養(yǎng),在10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)下,貼壁后呈多角形生長。
　　2.由上海漢恒股份有限公司建立Her2 siRNA慢病毒載體,包裝產(chǎn)生的病毒滴度為1×108TU/ml。
　　3.Her2 siRNA慢病毒感染人腦膜瘤細(xì)胞,當(dāng)MOI值為40時(shí),48小時(shí)后鏡下可見少量熒光表達(dá),72小時(shí)

4、后熒光表達(dá)量和強(qiáng)度增加。
　　4.CCK-8法檢測各組腦膜瘤細(xì)胞的增殖情況:與Control組相比,Her2 siRNA組抑制率最高(P<0.01);而病毒轉(zhuǎn)染后48小時(shí)開始對(duì)腦膜瘤細(xì)胞有抑制作用,72h抑制作用最強(qiáng);而Control組與Mock組相比并無差別(P>0.05)。
　　5.RT-PCR檢測Her2 mRNA的表達(dá)情況:與Control組、Mock組相比,Her2 siRNA組的mRNA的表達(dá)程度顯著下調(diào)(P<0

5、.01)。
　　6.Western blot檢測Her2、VEGF、Ki-67蛋白的表達(dá)變化:與Control組與Mock組相比,Her2 siRNA組的蛋白表達(dá)程度顯著下調(diào)(P<0.01);而Control組與Mock組相比無明顯差別(P>0.05)。
　　7.裸鼠移植瘤變化:與Control組和Mock組相比,Her2 siRNA組的細(xì)胞接種于裸鼠腋下的移植瘤發(fā)展速度明顯減慢(P<0.01),Control組與Mock組