卡介菌多糖核酸對(duì)小鼠特應(yīng)性皮炎模型的影響.pdf

1、特應(yīng)性皮炎(AD)是一種常見(jiàn)的瘙癢性皮膚病,通常與過(guò)敏性鼻炎和哮喘等過(guò)敏性疾病相關(guān)。60％的特應(yīng)性皮炎病例出現(xiàn)在出生后第1年,嬰兒期,濕疹樣皮損通常開(kāi)始為頰部紅斑和脫屑,抓痕常在數(shù)星期后出現(xiàn),伴隨糜爛結(jié)痂。兒童期皮損好發(fā)于摺縫、項(xiàng)背、以及四肢的伸側(cè),表現(xiàn)為苔蘚化、浸潤(rùn)性斑塊。青春期及成人期,苔蘚樣皮損常影響四肢屈側(cè)、頭和頸部。在每一個(gè)階段,都會(huì)出現(xiàn)不同程度的瘙癢,夜間加重,從而導(dǎo)致睡眠不足,進(jìn)而嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量。AD病情的嚴(yán)重程度

2、、復(fù)發(fā)率在不斷加劇,引起了廣大學(xué)者的研究興趣,但是到目前為止其確切的發(fā)病機(jī)制還不十分清楚,臨床治療比較棘手。因此研究AD的發(fā)病機(jī)理及尋找治療藥物是十分必要的。
　　 卡介菌多糖核酸是從卡介菌中經(jīng)熱酚法提取多糖、核酸而制成的新型免疫調(diào)節(jié)劑,臨床研究顯示應(yīng)用BCG-PSN治療過(guò)敏性鼻炎、哮喘、慢性蕁麻疹等過(guò)敏性疾病取得了滿意的療效。但對(duì)于治療特應(yīng)性皮炎的基礎(chǔ)研究和對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。為此,本研究利用NC/Nga小鼠作為AD

3、小鼠模型,觀察BCG-PSN對(duì)NC/Nga小鼠皮炎嚴(yán)重程度、搔抓頻率、耳朵厚度、血漿內(nèi)IgE、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ蛋白水平和脾臟組織IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γmRNA表達(dá)的影響,旨在探討B(tài)CG-PSN對(duì)Nc/Nga小鼠皮損的治療作用及其作用機(jī)制。培養(yǎng)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DC2.4細(xì)胞株),觀察不同劑量BCG-PSN對(duì)小鼠DC2.4細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞膜表面分子MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表達(dá)、上清液

4、中IL-12、IL-10蛋白水平和DC2.4細(xì)胞IL-12、IL-10 mRNA表達(dá)的影響;抗TLR2;4、9抗體預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h后,觀察BCG-PSN對(duì)DC2.4細(xì)胞分泌IL-12蛋白和IL-12p40 mRNA的影響;NF-κB抑制劑PDTC預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h,觀察BCG-PSN對(duì)其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表達(dá)、IL-12分泌以及NF-κB RelB/p50的影響,旨在探討B(tài)CG-PSN對(duì)樹(shù)突狀細(xì)胞的生物學(xué)作用并明

5、確其信號(hào)傳導(dǎo)通路。通過(guò)對(duì)新生Nc/Nga小鼠早期多次注射不同劑量的BCG-PSN,觀察Nc/Nga小鼠成年后特應(yīng)性皮炎樣皮損、皮炎評(píng)分、搔抓頻率、外周血血漿IgE的濃度以及脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4、IL-12的蛋白水平,觀察背部皮損組織病理學(xué)變化和免疫組化檢測(cè)IFN-γ蛋白的表達(dá)強(qiáng)度,旨在探討早期多次注射BCG-PSN對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的預(yù)防作用及其可能機(jī)制。
　　 第一部分卡介菌多糖核酸對(duì)Nc/Nga

6、小鼠皮炎的影響目的研究BCG-PSN對(duì)特應(yīng)性皮炎動(dòng)物模型Nc/Nga小鼠的治療作用及其可能機(jī)制。
　　 方法20只7周齡Nc/Nga雌鼠隨機(jī)平均分成4組:對(duì)照組、模型組、BCG-PSN組、DXM組。皮炎模型建立:鼠齡7周,對(duì)照組小鼠足墊及除毛之后腹部外涂丙酮溶液100μl,模型組、BCG-PSN組和DXM組小鼠足墊及除毛之后腹部外涂含5％DNCB的丙酮溶液100μl;鼠齡8～13周,對(duì)照組耳朵皮膚外涂丙酮溶液100μl,模型組、

7、BCG-PSN組和DXM組小鼠耳部皮膚涂抹含0.1％DNCB的丙酮溶液100μl,每周1次。給藥:對(duì)照組和模型組腹腔注射生理鹽水100μl,BCG-PSN組按0.5mg/kg腹腔注射BCG/PSN,DXM組按0.1 mg/kg腹腔注射DXM,每周1次,共7周。每周計(jì)數(shù)1次10min內(nèi)Nc/Nga小鼠搔抓次數(shù)并利用游標(biāo)卡尺測(cè)量小鼠耳朵厚度,末次給藥后眼球摘除取血、無(wú)菌取脾臟,甲醛同定耳部組織,制作石蠟包塊。EL,ISA檢測(cè)血漿內(nèi)IgE和I

8、L-4、IL-10、IL-12、IFN-γ的蛋白水平,實(shí)時(shí)定量rt-PCR檢測(cè)脾臟組織中IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ mRNA的表達(dá)水平,石蠟包塊切片行HE染色分析耳部組織皮損炎癥程度。
　　 結(jié)果(1)各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵皮損及組織病理學(xué)變化:對(duì)照組小鼠毛發(fā)光亮,無(wú)明顯皮損產(chǎn)生,組織病理示稀疏淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),輕度角化。模型組小鼠雙側(cè)耳朵出現(xiàn)腫脹、紅斑、滲出、表皮剝脫、結(jié)痂等表現(xiàn),皮損組織病理可見(jiàn)角化過(guò)度、灶性角化不全

9、、棘層肥厚、輕度海綿水腫、真皮內(nèi)有大量淋巴細(xì)胞伴漿細(xì)胞浸潤(rùn),血管擴(kuò)張充血。BCG-PSN組紅斑、滲出較模型組減輕,皮損組織病理僅表現(xiàn)為輕微角化過(guò)度、輕度海綿水腫、真皮淺層少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),DXM組耳朵腫脹較模型組減輕,皮損組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少。(2)各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳朵厚度及搔抓行為:模型組小鼠耳朵厚度及搔抓頻率與對(duì)照組相比,明顯增高。BCG-PSN組和DXM組與模型組相比,均可降低DNCB致敏所致小鼠耳朵增厚和搔抓行為,BCG-PSN與D

10、XM之間無(wú)差異。(3)與對(duì)照組相比,模型組小鼠血漿內(nèi)IgE、IL-4和IL-10增高,脾臟組織IL-4和IL-10mRNA的表達(dá)增高。BCG-PSN可以提高血漿內(nèi)IL-12和IFN-γ蛋白濃度和脾臟組織IL-12p40和IFN-γmRNA的表達(dá),抑制Nc/Nga小鼠血漿內(nèi)IgE的水平。DXM可降低血漿內(nèi)IgE水平,增加IL-10的含量,減少I(mǎi)L-4、IL-12、IFN-γ表達(dá)。
　　 結(jié)論我們外用DNCB致敏Nc/Nga小鼠成功

11、建立小鼠特應(yīng)性皮炎模型;BCG-PSN主要通過(guò)降低IgE水平、增加IL-12和IFN-γ,對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損產(chǎn)生抑制作用。
　　 第二部分卡介菌多糖核酸對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的影響目的研究BCG-PSN對(duì)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞(DC2.4細(xì)胞株)分泌細(xì)胞因子IL-10、IL-12和細(xì)胞表面MHC-Ⅱ、CD83、CD86蛋白表達(dá)的影響。
　　 方法用終濃度5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN刺激小

12、鼠DC2.4細(xì)胞,48h后倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞儀檢測(cè)主要組織相容性復(fù)合物類分子(MHC-Ⅱ)及協(xié)同刺激分子CD83、CD86蛋白表達(dá)水平,ELISA方法檢測(cè)上清液中IL-12、IL-10的蛋白含量,實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定IL-10、IL-12p40 mRNA的表達(dá)情況;抗TLR2、TLR4、TLR9抗體分別預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h后,ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞上清液中IL-12的蛋白含量,實(shí)時(shí)定量RT-PCR測(cè)定IL-12

13、p40mRNA的表達(dá)情況;PDTC預(yù)處理DC2.4細(xì)胞1h,觀察BCG-PSN對(duì)其表面分子DC83、MHC-Ⅱ表達(dá)及IL-12分泌的影響,并檢測(cè)NF-κBRelB/p50的活性。
　　 結(jié)果不同濃度BCG-PSN與DC2.4細(xì)胞共同培育后,細(xì)胞體積增大。細(xì)胞突觸增粗并隨BCG-PSN濃度增高而增多;5μg/ml、20μg/ml、50μg/ml BCG-PSN組DC2.4細(xì)胞表面共刺激分子CD83和組織相容性復(fù)合物MHC-Ⅱ分子表

14、達(dá)水平高于空白對(duì)照組(P＜0.05),CD86在各組細(xì)胞均為高度表達(dá),組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。DC2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-12隨BCG-PSN濃度的增加而增加,與對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,BCG-PSN可以促進(jìn)IL-12p40 mRNA表達(dá),呈劑量依賴性?？筎LR4抗體預(yù)處理后,IL-12分泌和IL-12p40 mRNA表達(dá)減少,與對(duì)照組相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,抗TLR2或抗TLR9抗體預(yù)處理對(duì)BCG-PSN的作用沒(méi)有影響。PDTC預(yù)處理DC

15、2.4細(xì)胞,可以阻斷BCG-PSN促DC2.4細(xì)胞IL-12p40基因轉(zhuǎn)錄的作用,培養(yǎng)細(xì)胞上清液中IL-12的含量沒(méi)有增加。
　　 結(jié)論 BCG-PSN可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞CD83、MHC-Ⅱ的表達(dá),增加IL-12的分泌;DC2.4細(xì)胞通過(guò)TLR4受體識(shí)別BCG-PSN,繼而激活NF-κB,從而促進(jìn)IL-12p40基因轉(zhuǎn)錄。
　　 第三部分:早期注射卡介菌多糖核酸對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎的預(yù)防作用目的研究早期多次注射

16、BCG-PSN對(duì)Nc/Nga小鼠特應(yīng)性皮炎樣皮損的預(yù)防作用并探討其可能的機(jī)制。
　　 方法新生Nc/Nga小鼠隨機(jī)分為3組:對(duì)照組(n=4)、0.1mg/kgBCG-PSN組(n=5)、0.5mg/kg BCG-PSN組(n=7)。BCG-PSN各組在出生后第1、8、15、22天分別皮下注射0.1mg/kg和0.5mg/kg的BCG-PSN,對(duì)照組以等量的生理鹽水代替;鼠齡第48天,8％的硫化鈉脫去背部鼠毛;鼠齡第49天,用1％

17、DNCB致敏小鼠,鼠齡第56、63、70天外用0.1％DNCB進(jìn)行激發(fā);第57、64、71天進(jìn)行皮炎評(píng)分、拍照、眶后靜脈采血、觀察并記錄搔抓行為,第72天處死小鼠并收集血漿、脾臟和背部皮損組織。ELISA方法檢測(cè)血漿中IgE的濃度和脾臟單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4和IL-12的濃度,免疫組化觀察皮損中IFN-γ的表達(dá),HE染色觀察皮損組織病理學(xué)改變。
　　 結(jié)果早期重復(fù)注射BCG-PSN,可以顯著改善DNCB致敏Nc/Nga小

18、鼠皮損炎癥程度,降低皮炎評(píng)分以及小鼠的搔抓行為,不同劑量BCG-PSN組之間搔抓頻率無(wú)差異。BCG-PSN可以降低血漿中IgE的含量,呈劑量依賴性。0.5mg/kgBCG-PSN可增加皮損中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)量。不同劑量BCG-PSN均可降低脾單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-4的含量,增加IL-12的濃度。
　　 結(jié)論早期注射BCG-PSN可通過(guò)促進(jìn)分泌IFN-γ細(xì)胞的增生,增加IL-12合成,降低IL-4和IgE的含量,從而有