腫瘤靶向的小分子化合物及長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及生物活性研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：Stat3磷酸化抑制劑Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體的制備及抗腫瘤活性研究
　　 復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的腫瘤,惡性程度增加,對(duì)原治療方法敏感性顯著降低,極難治愈,是目前臨床腫瘤治療中遇到的最大難題之一。最新研究認(rèn)為這種抗治療效應(yīng)是由于腫瘤中存在一類特殊的細(xì)胞亞群--腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells)所致,腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中少數(shù)具有自我更新能力(Self-renewal)并且能產(chǎn)生異質(zhì)性腫

2、瘤細(xì)胞的細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞對(duì)化學(xué)治療相對(duì)耐藥,對(duì)放射治療不敏感。抵抗治療而存活的腫瘤干細(xì)胞是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根本因?yàn)?因此研究針對(duì)腫瘤干細(xì)胞的靶向治療將有助于開拓腫瘤治療的新思路,為從根本上治愈腫瘤提供可能。
　　 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)是EGFR、IL-6/JAK、SRC等多個(gè)致癌性酪氨酸激酶信號(hào)通道的匯聚的焦點(diǎn),在多種腫瘤細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)有持續(xù)性過度激活,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系。此外,STAT3能夠調(diào)節(jié)腫

3、瘤干細(xì)胞的自我更新能力和增殖能力,對(duì)腫瘤干細(xì)胞的生長和維持非常重要。這些生物學(xué)信息均提示我們,開發(fā)新的抗腫瘤藥物,STAT3是一個(gè)非常具有吸引力的分子靶點(diǎn)。
　　 本課題研究的化合物Flll32,最初設(shè)計(jì)的目的就是選擇性靶向到STAT3。初步生物活性研究結(jié)果表明,Flll32特異性作用于JAK2/STAT3,抗腫瘤活性強(qiáng)。但是Flll32水溶性差的缺點(diǎn),限制了進(jìn)一步的體內(nèi)生物活性研究,而且水溶性差,很可能會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)生物利用度低。

4、而這一問題可以制備脂質(zhì)體劑型來解決。
　　 本文綜述了腫瘤干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)、生物學(xué)特性以及在實(shí)體瘤中的研究進(jìn)展,本文還綜述了STAT3與腫瘤發(fā)生發(fā)展的密切關(guān)系,并簡單介紹了脂質(zhì)體的特性和作為藥物載體的優(yōu)點(diǎn)。本課題的研究內(nèi)容包括制備Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體,優(yōu)化劑型處方并對(duì)脂質(zhì)體的物理參數(shù)進(jìn)行表征；在此基礎(chǔ)上研究Flll32脂質(zhì)體體內(nèi)外抗腫瘤活性以及對(duì)腫瘤干細(xì)胞的作用。課題的研究成果包括如下內(nèi)容:
　　 1.以薄膜水化一超聲法

5、制備了Flll32長循環(huán)脂質(zhì)體,脂質(zhì)體膜材由蛋黃卵磷脂(EPC)、膽固醇(Chol)和甲氧基聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mPEG2000-DSPE)組成。通過考察Chol含量、EPC濃度以及藥脂比對(duì)Flll32包封率的影響,確定了最佳處方為EPC:Chol:mPEG2000-DSPE:Flll32=18:2:1:2(摩爾比),其中EPC濃度為18mM。根據(jù)該處方制備的長循環(huán)脂質(zhì)體,Flll32包封率高達(dá)97％以上,平均粒度為

6、91.29±1.19nm(n=3)。
　　 2.體外抗腫瘤活性研究中,通過細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)(WST-8法),檢測化合物的細(xì)胞毒性；通過克隆形成實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)化合物對(duì)細(xì)胞增殖的影響；聯(lián)合細(xì)胞周期測定、WesternBlot檢測Cleaved PARP和Caspase-3功能活化測定實(shí)驗(yàn),檢測細(xì)胞凋亡；從蛋白和基因水平,評(píng)價(jià)化合物對(duì)STAT3及下游靶基因的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Flll32能夠有效抑制胰腺癌細(xì)胞的STAT3磷酸化,降低下游

7、靶基因Bcl-xL(2)、Survivin、Cyclin D1和c-Myc的表達(dá)水平,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Flll32與化療藥物聯(lián)合使用具有協(xié)同作用,與放射治療聯(lián)合使用具有放射增敏作用。Flll32脂質(zhì)體短時(shí)間作用活性稍弱于游離化合物,但長時(shí)間作用活性則強(qiáng)于游離化合物,且表現(xiàn)出安全性更高的優(yōu)點(diǎn)。
　　 3.體內(nèi)抗腫瘤活性研究中,通過繪制腫瘤生長曲線和體積倍增曲線,評(píng)價(jià)化合物的抗腫瘤活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Flll32及其

8、脂質(zhì)體有效抑制荷瘤裸鼠腫瘤生長延緩腫瘤倍增,而該作用是通過抑制STAT3磷酸化產(chǎn)生的。Flll32脂質(zhì)體與放射治療聯(lián)合使用,幾乎完全抑制腫瘤生長,效果大大優(yōu)于二者單獨(dú)使用,協(xié)同作用明顯。
　　 4.對(duì)腫瘤干細(xì)胞作用的研究中,Tumorsphere形成實(shí)驗(yàn)檢測化合物對(duì)腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的影響；以流式細(xì)胞儀檢測ALDH+細(xì)胞比例,反映化合物對(duì)腫瘤干細(xì)胞比例的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,Flll32及其脂質(zhì)體有效抑制Tumorsphere

9、形成數(shù)目和體積,下調(diào)Panc1細(xì)胞和Panc1細(xì)胞移植瘤組織中ALDH+細(xì)胞比例,同時(shí)還能中和放射治療升高ALDH+細(xì)胞比例的作用。因此推斷Flll32作為STAT3磷酸化抑制劑,在殺死普通腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也能殺死腫瘤干細(xì)胞。
　　 第二部分：Gefitinib類似物生物活性篩選及優(yōu)選化合物抗腫瘤活性研究
　　 分子靶向治療是近十年來逐漸發(fā)展起來的腫瘤治療的新手段,所謂分子靶向治療,是以腫瘤相關(guān)的分子為靶點(diǎn),將藥物等有效成

10、分靶向定位到癌細(xì)胞,從而達(dá)到治療腫瘤的目的。彌補(bǔ)了傳統(tǒng)腫瘤治療方法選擇性低、毒副作用大的缺點(diǎn)。
　　 EGFR是第一個(gè)與人腫瘤直接相關(guān)聯(lián)的酪氨酸激酶,在多種上皮來源的實(shí)體瘤中表現(xiàn)出過表達(dá)；EGFR的活化在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用,因?yàn)镋GFR信號(hào)通路與促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活、抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)。因此EGFR是腫瘤分子靶向治療中一個(gè)很有吸引力的分子靶點(diǎn)。隨著作用于EGFR小分子抑制劑Gefitinib、Erlotinib和La

11、patinib相繼進(jìn)入臨床使用,更是說明了人們對(duì)于EGFR作為分子靶點(diǎn)的關(guān)注。本文綜述了EGFR與腫瘤的密切關(guān)系,以及作用于EGFR的酪氨酸激酶小分子抑制劑的研究進(jìn)展。對(duì)本實(shí)驗(yàn)室以Gefitinib為先導(dǎo)化合物而設(shè)計(jì)合成的20個(gè)類似物進(jìn)行抑制激酶活性和細(xì)胞毒性的生物活性篩選,對(duì)活性較好的化合物作進(jìn)一步體內(nèi)外抗腫瘤活性和作用機(jī)制研究。課題的研究成果包括如下內(nèi)容:
　　 1.生物活性篩選中,通過細(xì)胞活性測定實(shí)驗(yàn)(WST-8法),檢測

12、化合物的細(xì)胞毒性；使用激酶檢測試劑盒,通過ELASA法體外檢測激酶活性,考察化合物對(duì)激酶活性的抑制作用。結(jié)果表明,大部分新化合物對(duì)測試的6種人腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性均強(qiáng)于Gefitinib,抗腫瘤活性增強(qiáng),但是對(duì)EGFR激酶的抑制作用均有不同程度的降低；化合物12、15、17、18和19有可能同時(shí)作用于EGFR、HER-2和c-MET,成為多受體酪氨酸激酶抑制劑。
　　 2.對(duì)優(yōu)選化合物15和17的體外抗腫瘤活性研究中,通過檢測細(xì)胞

13、生長曲線和克隆形成實(shí)驗(yàn),評(píng)價(jià)化合物對(duì)細(xì)胞生長和增殖的影響；聯(lián)合細(xì)胞周期測定、Western Blot檢測Cleaved PARP和Caspase-3功能活化測定實(shí)驗(yàn),檢測細(xì)胞凋亡；聯(lián)合Western Blot檢測LC3-Ⅱ和轉(zhuǎn)染GFP-LC3質(zhì)粒觀察斑點(diǎn)狀分布,檢測細(xì)胞自噬。研究結(jié)果表明,化合物15和17對(duì)HER-2高表達(dá)的人胰腺癌細(xì)胞Miapac2生長和增殖的抑制活性大大強(qiáng)于Gefitinib；化合物15和17通過誘導(dǎo)凋亡和自噬兩種方

14、式促進(jìn)Miapac2細(xì)胞死亡,Gefitinib只通過較弱的誘導(dǎo)自噬的方式殺死細(xì)胞。這可能就是化合物15和17體外抗腫瘤活性大大強(qiáng)于Gefitinib的因?yàn)椤?br>　　 3.對(duì)優(yōu)選化合物15和17的體內(nèi)抗腫瘤活性研究中,通過對(duì)預(yù)處理細(xì)胞成瘤能力的檢測,評(píng)價(jià)化合物抑制腫瘤形成的能力；通過繪制腫瘤生長曲線和體積倍增曲線,評(píng)價(jià)化合物的抗腫瘤活性。與Gefitinib相比,化合物15和17能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的形成；相同劑量處理荷瘤裸鼠,