CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的發(fā)生.pdf

1、胃癌是世界上常見的惡性腫瘤之一，據文獻統(tǒng)計，2012年有951600例新發(fā)胃癌病例，胃癌死亡病例則高達723100例。隨著醫(yī)學治療相關研究的發(fā)展，化療藥物對胃癌的治療效果越來越顯著，但胃癌的多藥耐藥現(xiàn)象成為影響胃癌患者治療效果的重要難題。
　　為了解決胃癌多藥耐藥導致的治療難題，研究人員進行了大量的研究。本實驗室也正在開展一系列更加深入的研究工作。目前我們已建立了多株胃癌耐藥細胞亞系，并應用糖蛋白組學鑒定和lncRNA芯片,成功篩

2、選鑒定出一系列耐藥相關基因和分子。因為胃癌的多藥耐藥機制十分復雜，我們篩選出的耐藥相關基因和分子不能完全闡明胃癌多藥耐藥發(fā)生發(fā)展的過程。
　　正確的糖基化修飾方式是維持蛋白質正常生物活性的基礎，糖基化修飾錯誤會導致糖蛋白的合成減少或功能喪失。已有多篇文獻報道在多種腫瘤中糖基化修飾在多藥耐藥發(fā)生過程中扮演了重要角色。近期，越來越多的研究人員將目光聚焦于糖蛋白對腫瘤的影響，因此我們選取多株胃癌耐藥系，通過糖蛋白捕獲策略鑒定出11個表達

3、差異明顯的糖蛋白。這些糖蛋白很可能是預測胃癌多藥耐藥的生物標志物或者具有關鍵調節(jié)作用。CACNA2D1是表達差異最明顯的糖蛋白之一。查閱文獻，我們發(fā)現(xiàn)CACNA2D1主要在神經信號傳導方面發(fā)揮重要作用，目前關于CACNA2D1分子及其糖基化在胃癌多藥耐藥中的作用及機制尚未見報道，我們將在本研究中對CACNA2D1的糖基化修飾與胃癌多藥耐藥的關系進行初步探討。
　　目的：
　　明確CACNA2D1在胃癌組織內表達及與臨床預后的

4、關系；探討CACNA2D1表達變化對胃癌細胞耐藥的作用及相關機制；研究糖基化修飾改變對CACNA2D1調節(jié)胃癌耐藥功能的影響，最終初步闡明CACNA2D1作為糖蛋白參與調節(jié)胃癌多藥耐藥惡性表型的作用路徑。
　　方法：
　　1.免疫組織化學檢測CACNA2D1在胃癌組織內的表達，并采用Kaplan-Meier方法分析CACNA2D1與胃癌患者臨床預后之間的聯(lián)系。
　　2.qRT-PCR和Western-blot實驗檢測C

5、ACNA2D1在胃癌耐藥細胞系及其親本細胞系的表達。
　　3.擴增和鑒定CACNA2D1正義和反義載體，并建立穩(wěn)轉細胞系，通過MTT方法、凋亡實驗和藥物泵出實驗檢測CACNA2D1表達改變后，對細胞功能的影響。
　　4.擴增和鑒定CACNA2D1的糖基化位點突變載體，并建立相關穩(wěn)轉細胞系。通過MTT和藥物泵出實驗檢測糖基化位點改變后，CACNA2D1的功能影響是否改變。
　　結果：
　　1、CACNA2D1在胃癌

6、組織中高表達與胃癌病人的預后密切相關
　　qRT-PCR檢測了16對新鮮胃癌組織及配對的癌旁組織，發(fā)現(xiàn)CACNA2D1在胃癌組織中的表達明顯高于癌旁組織。同時，免疫組織化學檢測CACNA2D1在89例胃癌和癌旁組織內表達，結果顯示CACNA2D1在43例胃癌組織中呈陽性表達，表達陽性率為48.3％，明顯高于配對的癌旁組織的表達陽性率13.4%(12/89)。統(tǒng)計學單因素分析發(fā)現(xiàn)CACNA2D1與胃癌患者臨床預后存在聯(lián)系，CACNA

7、2D1表達陽性的胃癌患者生存期較短。(p＜0.05）
　　2、CACNA2D1在胃癌耐藥細胞中的表達升高
　　我們通過qRT-PCR和Western blot實驗檢測CACNA2D1在胃癌耐藥細胞系SGC7901/VCR、SGC7901/ADR和其親本細胞SGC7901中的表達水平，結果顯示在胃癌耐藥細胞系中，CACNA2D1的表達明顯高于親本細胞，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。同時我們發(fā)現(xiàn)，在耐藥細胞中，CACNA2

8、D1的糖基化修飾程度要高于親本細胞中。
　　3、CACNA2D1可以促進胃癌細胞的耐藥
　　我們通過MTT檢測細胞IC50發(fā)現(xiàn)在胃癌耐藥細胞系中降低CACNA2D1的表達后，細胞對ADR、5-fu和CDDP等化療藥物的敏感性均明顯上升；而上調親本細胞系中CACNA2D1的表達則可以顯著降低胃癌細胞對化療藥物的敏感性。
　　流式細胞儀測定細胞凋亡結果顯示，胃癌耐藥細胞系中 CACNA2D1表達下調后，凋亡細胞明顯增多，提

9、示下調CACNA2D1可以增強耐藥細胞對5-fu的藥物敏感性；反之，在親本細胞系中上調CACNA2D1表達則可以降低胃癌細胞對5-fu的藥物敏感性。
　　同樣，藥物泵出實驗結果顯示，抑制CACNA2D1的表達后耐藥細胞藥物泵出能力減弱；而上調CACNA2D1，胃癌細胞對阿霉素泵出能力明顯下降。
　　4、CACNA2D1的糖基化修飾可以促進胃癌多藥耐藥
　　通過基因定點突變我們成功構建了CACNA2D1糖基化位點突變載體

10、并進行細胞轉染，MTT實驗結果顯示，突變的CACNA2D1蛋白對藥物的耐受能力明顯低于野生型的CACNA2D1蛋白；藥物泵出實驗顯示，突變的CACNA2D1蛋白藥物泵出能力減弱。
　　結論：
　　1、在配對的胃癌癌旁組織中，CACNA2D1在胃癌組織的表達水平及強度明顯高于癌旁組織；統(tǒng)計學分析提示CACNA2D1與胃癌患者生存預后呈負相關聯(lián)系。
　　2、CACNA2D1在胃癌耐藥細胞系中的表達明顯高于親本細胞，且以高糖