甘草酸抑制糖基化修飾調(diào)控EMT的機(jī)制研究.pdf

1、肺間質(zhì)纖維化(Pulmonary fibrosis)是一種慢性疾病，病程逐漸發(fā)展、不可逆轉(zhuǎn)，是間質(zhì)性肺疾病的終末期，據(jù)統(tǒng)計(jì)其平均生存期短，不足5年。肺間質(zhì)纖維化的患者呼吸困難明顯，生活難以自理，且花費(fèi)大，給社會(huì)、家庭、及個(gè)人帶來(lái)沉重的精神及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此延緩肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展、降低死亡率是我國(guó)肺病防治所面臨的巨大挑戰(zhàn)和重大需求。
　　雖然導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的病因不甚清楚，但肺間質(zhì)纖維化的病理表現(xiàn)與信號(hào)通路主要表現(xiàn)為：肺間質(zhì)中大量炎癥細(xì)

2、胞浸潤(rùn)，肌成纖維細(xì)胞顯著增多從而產(chǎn)生過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)積聚，最終出現(xiàn)纖維化的病理改變。目前尚無(wú)有效手段阻止其進(jìn)展。因此，闡明肺間質(zhì)纖維化發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，尋找有效的新的干預(yù)治療策略，對(duì)阻止疾病發(fā)展、降低死亡率有著重大的意義。
　　但是，目前我們尚不十分明確有關(guān)肺間纖維化這一疾病的發(fā)病機(jī)制。
　　肺間質(zhì)纖維化疾病病程中關(guān)鍵的病理改變包括肌成纖維細(xì)胞大量、異常增多。目前針對(duì)肌成纖維細(xì)胞的來(lái)源的研究較多，說(shuō)法不一，爭(zhēng)議較大。其研究結(jié)果

3、顯示多數(shù)觀點(diǎn)傾向主要來(lái)源為肺泡上皮細(xì)胞，即EMT(epithelial to mesenchymaltransition）。肺泡上皮細(xì)胞活化后的一個(gè)重要效應(yīng)是：轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，同時(shí)活化多種參與固有免疫、炎癥的基因等，促進(jìn)炎癥、氧化應(yīng)激損傷，從而加重肺間質(zhì)纖維化進(jìn)展。由此推測(cè)：肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化（EMT）是肺間質(zhì)中肌成纖維細(xì)胞的主要來(lái)源。深入研究EMT的機(jī)制及其活化后導(dǎo)致的重要分子生物學(xué)效應(yīng)，是尋求干預(yù)靶點(diǎn)的重要防

4、治策略。
　　綜上所述，肺間質(zhì)纖維化是一種難治、復(fù)雜的疾病。目前傳統(tǒng)激素及單通路受體阻滯劑（如吉非替尼）可能獲得部分療效，但不能阻止肺間質(zhì)纖維化的進(jìn)展。近年來(lái)有關(guān)我國(guó)中草藥方劑及其單體活性成分在疾病治療中的研究越來(lái)越多，其在肺間質(zhì)纖維化的治療中的作用也越來(lái)越引起大家的重視。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)活血化瘀方劑（黃芪、川芎、丹參、當(dāng)歸、紅景天、浙貝母、甘草）對(duì)肺間質(zhì)纖維化有治療作用。其中甘草酸（Glycyrrhizic acid，GA）

5、作為甘草中最主要的活性成分，大量研究表明甘草酸對(duì)臟器纖維化（如肝臟）有顯著的治療作用。但甘草酸對(duì)肺間質(zhì)纖維化是否有改善作用我們尚不清楚。因此我們提出以下科學(xué)問(wèn)題：多種炎癥、多條信號(hào)通路的過(guò)度激活是肺間質(zhì)纖維化的重要基礎(chǔ)，EMT又是導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化的重要途徑，是什么調(diào)控了這些炎癥因子和信號(hào)通路活性？甘草酸是否能夠找到控制它們活性的共同靶點(diǎn)？
　　近年，糖蛋白組學(xué)的飛速發(fā)展為我們解答以上問(wèn)題提供了新的研究方向。核心巖藻糖基化（core

6、 fucosylation，CF）是一種重要的蛋白質(zhì)糖修飾，是由α-1,6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶（Fucosyltransferase8，F(xiàn)UT8）特異性地催化轉(zhuǎn)移巖藻糖，將其連接在靶蛋白的特定氨基酸位點(diǎn)的核心糖鏈上，從而完成靶蛋白質(zhì)的折疊、空間構(gòu)象。我們課題組研究表明臟器纖維化中其關(guān)鍵蛋白均為糖蛋白，所以，我們思考：甘草酸是否通過(guò)CF修飾調(diào)控這些炎癥因子及信號(hào)通路的活性？
　　要解決上述科學(xué)問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)建立博來(lái)霉素（Bleomyci

7、n，BLM）誘導(dǎo)肺間質(zhì)纖維化大鼠模型明確甘草酸對(duì)肺間質(zhì)纖維化有無(wú)作用；在大鼠肺間質(zhì)纖維化模型上觀察甘草酸對(duì)EMT的影響；在此基礎(chǔ)上，通過(guò)觀察甘草酸對(duì)CF的影響進(jìn)而深入解析甘草酸抑制EMT的具體機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)甘草酸能減輕BLM誘導(dǎo)的肺間質(zhì)纖維化及抑制EMT；其次從糖生物學(xué)全新的角度闡釋了甘草酸治療肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制，填補(bǔ)了糖生物學(xué)在肺間質(zhì)纖維化領(lǐng)域的空白，為臨床研發(fā)新藥提供了全新思路。
　　第一部分
　　甘草

8、酸減輕BLM致肺間質(zhì)纖維化
　　目的：
　　探討甘草酸對(duì)BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化的病理影響，明確甘草酸對(duì)肺間質(zhì)纖維化有無(wú)干預(yù)作用。
　　方法：
　　利用BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，成功獲得肺臟大體標(biāo)本，使用不同劑量甘草酸觀察其對(duì)肺臟病理的影響及明確對(duì)肺間質(zhì)纖維化是否有治療作用。首先大體觀察甘草酸濕/干重比的影響；使用HE、Masson染色方法觀測(cè)甘草酸對(duì)肺臟病理的影響；利用免疫組化及免疫印跡技術(shù)檢測(cè)膠原蛋白Ⅰ、

9、Ⅲ的變化；其次利用ELISA法檢測(cè)大鼠的肺組織中Hyp含量，明確甘草酸對(duì)肺間質(zhì)纖維化是否有干預(yù)作用。
　　結(jié)果：
　　與正常組相比，BLM誘導(dǎo)的大鼠肺間質(zhì)纖維化中肺濕/干重比明顯升高；HE、Masson染色顯示肺臟病理明顯加重；免疫組化及免疫印跡顯示膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ表達(dá)明顯增加；ELISA檢測(cè)Hyp的含量明顯升高。經(jīng)甘草酸治療后，肺濕/干重比明顯降低;，肺臟病理明顯減輕，膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ及Hyp表達(dá)較纖維化組明顯降低，并隨甘草酸

10、劑量的升高而明顯減輕，其中高劑量甘草酸具有顯著的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　在BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化的模型中，甘草酸對(duì)抑制及保護(hù)肺間質(zhì)纖維化起到了一定作用，并呈劑量依賴性。
　　第二部分
　　甘草酸對(duì)EMT的影響
　　目的：
　　闡述甘草酸對(duì)肺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響，明確甘草酸阻抑EMT。
　　方法：
　　在用博來(lái)霉素制備的大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中，使用特有標(biāo)記物E-cadherin定位肺泡

11、上皮，觀察不同劑量甘草酸在肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成肌成纖維細(xì)胞中的影響，明確甘草酸阻抑EMT進(jìn)而減輕肺間質(zhì)纖維化。免疫熒光共染方法檢測(cè)不同劑量甘草酸對(duì)各組肺組織中E-cadherin、α-SMA的表達(dá)變化，免疫印跡方法對(duì)各組肺標(biāo)本中上述蛋白采用定量分析，明確不同劑量甘草酸對(duì)上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象的影響；免疫熒光檢測(cè)各組大鼠肺組織中p-Smad2/3、β-catenin的表達(dá)變化，利用免疫印跡方法對(duì)上述蛋白進(jìn)行定量分析，明確不同劑量甘草酸對(duì)肺臟纖

12、維化關(guān)鍵蛋白的影響。
　　結(jié)果：
　　免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示正常肺組織E-cadherin中等量表達(dá)，α-SMA低量表達(dá)。與正常組相比較，BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中α-SMA表達(dá)顯著升高，E-cadherin表達(dá)顯著下降；經(jīng)甘草酸治療后，免疫熒光及免疫印跡顯示上述兩種蛋白呈逆向變化，對(duì)EMT現(xiàn)象有明顯抑制作用。免疫熒光及免疫印跡結(jié)果顯示正常肺組織中p-Smad2/3、β-catenin低量表達(dá)。與正常組相比，BLM誘

13、導(dǎo)大鼠肺間質(zhì)纖維化模型中p-Smad2/3、β-catenin蛋白的表達(dá)顯著升高；經(jīng)甘草酸治療后，免疫熒光及免疫印跡顯示甘草酸明顯抑制上述兩種蛋白的表達(dá)。上述指標(biāo)均顯示與甘草酸的劑量相關(guān)。
　　結(jié)論：
　　在BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化中，EMT通路關(guān)鍵蛋白起到重要作用，甘草酸能夠干預(yù)EMT及上述蛋白的活化。
　　第三部分
　　甘草酸通過(guò)CF修飾調(diào)控EMT的機(jī)制
　　目的：
　　探討核心巖藻糖基化修飾對(duì)E

14、MT關(guān)鍵信號(hào)通路的影響，深入解析甘草酸調(diào)控FUT8阻抑EMT。
　　方法：
　　利用BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化模型，觀察核心巖藻糖基化修飾水平變化及核心巖藻糖基化修飾對(duì)TGF-β/Smad2/3、Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響，深入解析甘草酸對(duì)核心巖藻糖基化修飾的水平變化。首先免疫熒光雙染法觀察大鼠肺臟中CF表達(dá)及甘草酸對(duì)大鼠肺臟CF修飾水平的變化；其次應(yīng)用免疫熒光、免疫印跡檢測(cè)TGF-βR、WNT核心巖藻糖基化水平

15、及甘草酸對(duì)上述受體蛋白及CF修飾水平變化。
　　結(jié)果：
　　正常肺臟組織中存在中等量的CF修飾水平。與正常組比較，BLM致大鼠肺間質(zhì)纖維化中，CF修飾水平明顯增加；大鼠肺臟中TGF-βR、WNT及其核心巖藻糖基化水平顯著升高（p<0.001）；甘草酸能明顯抑制BLM誘導(dǎo)纖維化大鼠肺臟中TGF-βR、WNT受體蛋白的核心巖藻糖基化修飾水平（p<0.01），但是并未影響受體本身的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　在BLM致大鼠