Tim-3表達(dá)與前房相關(guān)免疫偏離形成相關(guān)性的研究.pdf

1、前房相關(guān)免疫偏離(anterior chamber—associated immune deviation，ACAID)是指前房引入抗原(人工引入或眼內(nèi)抗原進(jìn)入)后，誘導(dǎo)出特異性非補(bǔ)體結(jié)合性抗體和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的前體細(xì)胞，但不能誘導(dǎo)出遲發(fā)型超敏反應(yīng)(delayed-type hypersensitivity，DTH)。ACAID將進(jìn)入房水的抗原轉(zhuǎn)化成對機(jī)體有保護(hù)作用的信號，避免有害信號的生成，從而維持眼內(nèi)免疫微環(huán)境的穩(wěn)定性，保證正常的視

2、功能。此外，ACAID還是維持角膜移植高成功率的關(guān)鍵因素之一，并且對眼內(nèi)惡性腫瘤的消長和阻止眼內(nèi)腫瘤的全身轉(zhuǎn)移等均有重要影響。因此，ACAID不但引起了眼科學(xué)家的重視，還引起了免疫學(xué)家和腫瘤學(xué)家的極大興趣。研究表明，ACAID的形成與眼一脾軸、房水中β-轉(zhuǎn)化生長因子、眼局部解剖結(jié)構(gòu)等多種因素有關(guān)，它是眼內(nèi)一種固有的免疫抑制現(xiàn)象，其本質(zhì)被認(rèn)為是Th2細(xì)胞激活和Thl細(xì)胞受到抑制，是機(jī)體的Thl／Th2平衡由Thl免疫應(yīng)答向Th2免疫應(yīng)答的

3、免疫偏離。以往的許多報道認(rèn)為，前房引入抗原后，與Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子如IL-4、IL-10等的水平升高，而與Thl細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子如IL一2、IFN-γ等的水平降低。最近研究發(fā)現(xiàn)，ACAID不僅能夠抑制Thl免疫應(yīng)答如DTH，而且能夠抑制Th2免疫應(yīng)答如哮喘；ACAID中傳出支CD8<'+>調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的形成并不需要Th2性細(xì)胞因子(如IL-4、IL-13等)的參與。 因此，ACAID形成的確切機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

4、 目前，許多關(guān)于Th細(xì)胞的研究資料主要是采用ELISA等方法來檢測Th細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子的水平，從功能上來區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞亞群；而對于能直接從Th細(xì)胞的表型上來區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞的細(xì)胞表面分子則知之甚少。 2001年，V.K.K研究小組發(fā)現(xiàn)了一個新的基因家族，其結(jié)構(gòu)上含有免疫球蛋白V區(qū)和粘蛋白區(qū)，因而命名為T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白分子(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-con

5、taining molecules，Tim)家族。其中，Tim-3蛋白作為區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志，特異地表達(dá)在分化的Thl細(xì)胞而不是Th2細(xì)胞上，也不表達(dá)在初始T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞上。對于Tim-3的功能的系列研究發(fā)現(xiàn)，它是Thl細(xì)胞的負(fù)性調(diào)節(jié)子，通過與Tim-3配體(Tim-3L)相互作用而抑制Thl免疫應(yīng)答，在自身免疫性疾病、變態(tài)反應(yīng)性疾病、哮喘等疾病以及外周免疫耐受的形成中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。 A

6、CAID機(jī)制是近年來眼科免疫學(xué)領(lǐng)域里最重要的研究進(jìn)展，闡明其調(diào)控機(jī)制對于研的自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制以及發(fā)展新的防治策略具有重要的臨床意義。目前尚未見Tim分子在該領(lǐng)域的相關(guān)研究報道。本課題在BALB/c小鼠前房注射卵白蛋白(ovalbumin，OVA)誘導(dǎo)ACAID，建立動物模型；檢測DTH反應(yīng)以評價在前房注射OVA后的不同時間點(diǎn)ACAID是否誘導(dǎo)成功；獲取ACAID誘導(dǎo)過程中的各個時間點(diǎn)的小鼠脾細(xì)胞，采用熒光定量PCR方法和流式細(xì)胞

7、學(xué)方法分別從mRNA和蛋白水平檢測ACAID形成過程中Tim-3表達(dá)的動態(tài)變化，探討Tim-3分子在ACAID中可能發(fā)揮的作用。 本研究利用Tim-3可以作為新的區(qū)分Thl和Th2細(xì)胞的表面標(biāo)志，較以往通過檢測細(xì)胞因子的水平間接地判斷Thl/Th2細(xì)胞反應(yīng)更能直觀地評價ACAID的Thl/Th2細(xì)胞平衡的變化，從而可能為進(jìn)一步闡明ACAID機(jī)制提供新的思路，進(jìn)而為葡萄膜炎以及其它自身免疫性疾病的防治提供新的調(diào)控手段。 一

8、、ACAID模型的誘導(dǎo)和鑒定 目的：采用可溶性蛋白抗原卵白蛋白(OVA)誘導(dǎo)BALB/c小鼠的ACAID模型，以DTH反應(yīng)評價ACAID的形成，為以后的研究提供可靠的動物模型。 方法：采用乙醚吸入法麻醉動物，實(shí)驗(yàn)組小鼠(i.c.+s.c.)先于小鼠右眼前房注射(i.c.)OVA抗原，再分別于前房注射后的第0、3、7、14、21、28天，進(jìn)行頸項(xiàng)部皮下免疫注射(s.c.)OVA與完全弗氏佐劑(CFA)的混合液(即OVA-C

9、FA)，按照i.c.與s.c.之間所間隔的不同時間點(diǎn)，將實(shí)驗(yàn)組分為day 0、3、7、14、21、28亞組；陽性對照組小鼠(positive s.c.)僅進(jìn)行皮下免疫OVA-CFA；正常對照組小鼠(normal)未接受任何處理。實(shí)驗(yàn)組和陽性對照組小鼠均于皮下免疫后的第7天進(jìn)行耳廓皮內(nèi)注射(i.d.)OVA，正常對照組小鼠直接進(jìn)行耳廓皮內(nèi)注射OVA，觀察DTH反應(yīng)，評價ACAID的形成。 結(jié)果：在day 7、14、21、28亞組的

10、實(shí)驗(yàn)組小鼠中耳廓腫脹程度與陽性對照組小鼠的耳廓腫脹程度相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，DTH反應(yīng)受到明顯抑制。而在day 0和day 3亞組的實(shí)驗(yàn)組小鼠，其耳廓腫脹程度與陽性對照組的耳廓腫脹程度相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，DTH反應(yīng)強(qiáng)烈。 結(jié)論：在BALB/c小鼠的前房注射OVA抗原可以成功地誘導(dǎo)出ACAID；在前房注射后的day 0和day 3亞組小鼠，ACAID尚未形成；而在前房注射后的day 7、14

11、、2 1、28亞組小鼠，ACAID誘導(dǎo)成功。以O(shè)VA抗原誘導(dǎo)ACAID能夠?yàn)橐院蟮难芯刻峁┓€(wěn)定可靠的動物模型。 二、ACAID形成過程中脾臟Tim-3 mRNA的動態(tài)表達(dá) 目的：檢測ACAID形成過程中脾臟Tim-3 mRNA表達(dá)的動態(tài)變化。 方法：在前房注射OVA后的第0、3、7、14、21、28天分別進(jìn)行皮下 免疫OVA—CFA的實(shí)驗(yàn)組(即day 0、3、7、l 4、21、28 i.c+s.c)和陽性

12、對照組(positive s.c.)小鼠均在進(jìn)行皮下免疫OVA—CFA后的第7天被處死；正常對照組小鼠(normal)未接受任何處理，直接被處死。獲取各組小鼠脾臟，采用Trizol一步法提取脾細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測Tim-3 mRNA的表達(dá)水平。 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組小鼠的脾臟Tim-3 mRNA的表達(dá)水平在前房注射OVA后的day 3亞組中明顯增高，與陽性對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P

13、<0.01)；而在前房注射OVA后的day 7亞組中有所降低，但仍高于陽性對照組的表達(dá)水平(P<0.01)：在前房注射OVA后的dav 14、2l、28亞組中，Tim-3mRNA的表達(dá)水平逐漸接近于正常對照組的水平(P>0.05)。 結(jié)論：Tim-3 mRNA在ACAID的形成過程中呈動態(tài)變化，其表達(dá)水平在前房注射OVA后的day 3亞組中明顯升高，早于ACAID的形成時間，提示Tim-3可能參與了ACAID的形成。 三

14、、ACAID形成過程中脾臟Tim-3蛋白的動態(tài)表達(dá) 目的：檢測ACAID形成過程中脾臟Tim-3蛋白表達(dá)的動態(tài)變化。 方法：在前房注射OVA后的第0、3、7、14、2 1、28天分別進(jìn)行皮下免疫OVA—CFA的實(shí)驗(yàn)組小鼠(i.c.+s.c.)和陽性對照組小鼠(positire s.c.)均在進(jìn)行皮下免疫OVA—CFA后的第7天被處死；僅接受前房注射OVA的對照組小鼠(即OVA i.c.)在前房注射OVA后的第3、7天分別

15、被處死；正常對照組小鼠(normal)未接受任何處理，直接被處死。獲取各組小鼠脾臟，采用流式細(xì)胞學(xué)方法，用抗CD3、抗CD4和抗Tim-3單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面染色，檢測脾細(xì)胞中CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞的陽性表達(dá)率，同時以CD25分子作為活化T細(xì)胞的表面標(biāo)志，評價CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞的活化狀態(tài)。 結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)組小鼠(i.c.+s.c.)的脾臟中，CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞的陽性表達(dá)

16、率呈動態(tài)改變：脾臟CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞的表達(dá)率在前房注射OVA后的day 3亞組中明顯增高，與陽性對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；而在前房注射OVA后的day 7、14亞組中逐漸降低，與陽性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在前房注射OVA后的dav 28亞組中下降至正常對照組的水平(P>0.05)。在實(shí)驗(yàn)組的各個時間點(diǎn)小鼠的脾臟中，CD4<'+>CD25<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞陽性率

17、的變化趨勢與CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞陽性率的變化趨勢相一致；而實(shí)驗(yàn)組的各個時間點(diǎn)小鼠的脾臟中，CD4<'+>CD25<'->Tim-3<'+>T細(xì)胞的陽性率較恒定，且與陽性對照組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。在前房注射OVA對照組(OVA i.c.)的脾細(xì)胞中，CD4<'+>Tim-3<'+>T細(xì)胞的陽性表達(dá)率以及CD4<'+>CD25<'+>T細(xì)胞的陽性率均與正常對照組的陽性率結(jié)果相似。 結(jié)論：脾臟CD4