戊己丸不同配伍的腸吸收特征及與P-gp相互作用研究.pdf

1、1.實驗目的
　　 中藥復方配伍是中醫(yī)用藥的一大特色和優(yōu)勢，了解其配伍規(guī)律對臨床辨證施治有重要的指導意義。中藥復方多以口服形式入藥，藥物在腸道中的吸收是決定藥物生物利用度和影響藥物發(fā)揮治療作用的關鍵因素。本研究以戊己丸為例，利用正交設計的方法，從腸吸收角度，通過監(jiān)測中藥復方組成中藥的代表成份小檗堿（Ber）、巴馬汀（Pal）、吳茱萸堿（Evo）、吳茱萸次堿（Rut）、芍藥苷（Peo），以其數、量、相互比例為著眼點，研究戊己丸不同

2、比例的配伍腸道吸收過程中的動態(tài)變化規(guī)律，以及組成藥物的貢獻度、貢獻形式等，并以數學方程和圖解對其進行描述，借以探討中藥復方的配伍原理以及科學性。
　　 2.實驗方法和結果2.1戊己丸組方及其配伍的腸外翻吸收研究方法：采用L9（34）正交設計表，將戊己丸組方中的黃連、制吳茱萸、炒白芍作為3因素，各因素的3個不同劑量作為實驗的水平數，研究戊己丸9個不同配比及其相應的單味藥物在腸道中的吸收。采用腸外翻生物模型，以戊己丸中代表成份Ber

3、、Pal、Evo、Rut、Peo為檢測對象，用HPLC檢測五個成分在單味藥中的經時吸收量，用LC-MS同時檢測戊己丸配伍中五個代表成份的變化。通過單因素方差分析（ANOVA）、正交設計的方差分析及歸一化加權綜合評分法對實驗結果進行統計分析。
　　 結果：黃連提取物中Ber和Pal在腸道吸收過程中為零級吸收，其R2>0.9，在不同劑量時Kα顯示兩者為被動擴散，各腸段吸收總趨勢為空腸>回腸>結腸；制吳茱萸提取物中Evo和Rut在腸道

4、中為零級吸收，R2>0.9，Evo在小腸各段、Rut在空腸、回腸中均表現為主動轉運，Rut在結腸中Ka隨劑量增加而增加，表現為被動擴散形式，低劑量時結腸吸收少于空腸、回腸，高劑量時結腸多于空腸、回腸；Peo吸收為零級吸收，R2>0.9，吸收形式以被動擴散為主，不同腸段的吸收為空腸>回腸>結腸。
　　 用LC-MS結合快速分離色譜柱，建立同時測定戊己丸中5個性質不同化合物的分析檢測方法，實現了在較短時間內（t<3.5min）同時分

5、離目標檢測成分；同時對方中5個化學成分均采用ESI正離子模式選擇性離子檢測法，排除了其他雜質的干擾，方法操作簡單、快速、靈敏度高、特異性強、重現性好。正交設計研究顯示戊己丸中5個代表成份在不同配伍比例時在腸道的吸收動力學不同。在空腸、回腸、結腸中5個代表成分的最佳吸收組合分別為，Ber（12:6:3、12:6:3、12:2:3），Pal（12:1:12、12:1:12、12:2:12），Evo（6:6:3、6:6:3、6:6:3），Ru

6、t（12:6:12、12:6:3、12:6:3），Peo（6:2:6、6:2:6、6:6:6），相同成分在腸道不同部位的吸收趨勢大致相同，但不同成分之間的吸收趨勢變化較大。用多指標正交實驗分析方法進行方劑配伍比例的優(yōu)選，首先將分散的數據歸一化，使其具有可比性。然后針對指標間的重要性差異給出各指標的權重，本實驗依據戊己丸組方中的君臣佐使，確定Ber和Pal的權重為6，Evo、Rut和Peo的權重為4，給出綜合評分進行正交統計。結果為黃連在

7、各腸段吸收貢獻度最大，確定了其君藥地位，制吳茱萸和炒白芍次之，為臣藥，其吸收最優(yōu)配伍比例為黃連：制吳茱萸：炒白芍=6:3:6。
　　 2.2戊己丸單方及優(yōu)選配伍組方在Caco-2細胞中的吸收研究方法：利用Caco-2細胞類似小腸上皮細胞的特性，研究中藥提取物及其配伍在細胞中的攝取和轉運特征。攝取實驗將細胞種于24孔板，加藥1h后細胞勻漿，測定細胞內藥物含量；轉運實驗將細胞接種到Millicell小室膜上，待細胞具有極性、分化完成

8、、完整性好后進行轉運實驗，實驗時分別將藥物加入AP或BL側，檢測另一端小室內的藥物吸收/外排量的變化。
　　 結果：細胞生長21天堿性磷酸酶活力AP側為BL側的2倍以上（P<0.05），說明細胞具有極性，分化完成：熒光素鈉Papp值在4.4×10-7cm·sec-1，2h其透過率在0.7％，TEER值達到600Ω·c㎡（7-8d），證明細胞完整性較好，可以用于轉運實驗。
　　 Caco-2細胞實驗進一步證明了Ber、Pa

9、l、Peo以被動轉運為主，Pb-a/Pa-b比例均在1左右，Evo、Rut以主動轉運為主要轉運機制，Evo的Pb-a/Pa-b比例<0.5，Rut的Pb-a/Pa-b比例<0.8；配伍6:1:6時Ber、Pal、Evo的攝取和外排均有所增加，Ber吸收減少，Rut攝取、吸收和外排均不同程度降低。配伍12:2:3和12:1:12時各代表成份吸收變化趨勢大致相似，但在12:1:12配伍中Ber吸收增加、Evo細胞攝取量增多，這可能是引起兩個

10、配伍組產生相同藥效的同時各有側重點的原因。
　　 2.3戊己丸單方與P-gp相互作用研究方法：Ver抑制P-gp實驗，采用腸外翻法，在腸外加入含有或不含有Ver（100μM）的測試藥液，比較Ver對戊己丸組成單方中成分的吸收變化影響；Rho123外排實驗，大鼠按實驗分組分別給藥5天，用腸外翻模型研究對Rho123的外排改變情況。
　　 結果：Ber、Pal、Evo在加入Ver后，在腸道各段吸收沒有明顯改變，Pal在加入V

11、er后吸收略有增加，尤其以結腸和回腸吸收增加較多，Peo在回腸中吸收比不加Ver時有顯著增加（P<0.05），空腸和結腸改變不明顯。對Rho123外排影響，提前服用Ver后，Rho123的外排顯著減少（P<0.01），說明Ver抑制了P-gp，黃連組在空腸中對Rho123的外排也顯著減少（P<0.05），回腸中外排有減少趨勢。炒白芍組在回腸中Rho123外排顯著增加（P<0.01），其余各組對Rho123外排沒有明顯影響。
　　

12、 2.4戊己丸單方及不同配伍對MDR1-mRNA表達的影響方法：在Caco-2細胞中加入含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)2d，收集細胞后用Trizol一步法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，RT-PCR對MDR1-mRNA進行定量分析。
　　 結果：配伍6:1:6、12:2:3、12:1:12以及相同劑量黃連提取物單味藥物均可以降低MDR1-tuRNA的表達，制吳茱萸提取物及炒白芍提取物則可以誘導MDR1-mRNA表達，使其表達量增加。
　

13、　 3.結論
　　 本實驗利用腸外翻模型和Caco-2細胞模型，研究戊己丸組方中單味藥物和不同配=6:3:6為伍下的代表成份吸收變化情況，結果顯示戊己丸中代表成份在腸道中的吸收機制不同，不同配伍比例時吸收變化較大，經統計學分析最終得出黃連：制吳茱萸：炒白芍=6:3:6為最佳吸收配比，同時證明了黃連在方中的貢獻度最大，確定其君藥地位，制吳茱萸和炒白芍次之，為臣藥。通過研究戊己丸單方與配伍對P-gp的相互作用，證明戊己丸單方與不同