Notch1途徑在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、喉癌(laryngocarcinoma)是耳鼻咽喉科常見(jiàn)惡性腫瘤,其發(fā)病率約占全身腫瘤的1～5％,在耳鼻喉科領(lǐng)域中僅次于鼻咽癌和鼻腔癌、鼻竇癌,居第三位。喉癌的病因不明,可能與長(zhǎng)期過(guò)度煙、酒、有害化學(xué)氣體刺激有關(guān)。喉癌約占喉惡性腫瘤的98.1％,其中喉鱗狀細(xì)胞癌占85-90％,腺癌約占2％,其余為肉瘤。喉癌和其它腫瘤一樣,是一種多基因,多步驟,多階段的發(fā)生過(guò)程,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療困難。自20世紀(jì)80年代以來(lái),喉癌的治療取得了較大的進(jìn)展,

2、手術(shù)、放療、化療和免疫治療的聯(lián)合應(yīng)用,大大提高了患者5年的生存率。但手術(shù)、放療和化療引起的并發(fā)癥多,毒副作用大,因此利用分子生物學(xué)技術(shù)從分子水平研究喉癌的發(fā)病機(jī)理并尋找治療喉癌的分子靶點(diǎn)顯得十分迫切。
　　 Notch基因于1919年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn),當(dāng)時(shí)的研究發(fā)現(xiàn)如果該基因的部分功能缺失則會(huì)在果蠅翅膀的邊緣造成一些缺刻(notches),這也正是Notch基因命名的由來(lái)。目前,Notch1信號(hào)途徑是動(dòng)物細(xì)胞中研究最為廣泛的信號(hào)途

3、徑之一,顯示出良好的臨床應(yīng)用前景,是許多重要細(xì)胞信號(hào)途徑的交匯點(diǎn),提示該信號(hào)途徑在腫瘤的發(fā)生中具有重要的地位。陸續(xù)的研究表明,Notch1廣泛表達(dá)于多個(gè)不同的物種中,其家族成員的結(jié)構(gòu)具有高度的保守性,在個(gè)體系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞命運(yùn)決定、不同細(xì)胞的分化、模式形成、腫瘤的發(fā)生以及神經(jīng)退行性疾病等生理病理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。目前,Notch1與腫瘤之間關(guān)系的報(bào)道日益增多,其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著十分重要的作用,包括:乳腺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、

4、前列腺癌、腦癌以及食管癌等。此外,Notch1信號(hào)途徑在不同的腫瘤中的作用不完全相同,有時(shí)甚至在同一種腫瘤的不同時(shí)期作用也不盡相同,最具有典型代表的是宮頸癌組織中的研究,其結(jié)果表明,Notch1在宮頸癌發(fā)生的早期階段表現(xiàn)為促癌作用,而晚期階段表現(xiàn)為抑癌作用,這些研究提示Notch1在不同類(lèi)型的腫瘤中其表達(dá)和功能存在明顯的差異,這可能是由于Notch1途徑自身的復(fù)雜性所決定的。
　　 盡管目前Notch1信號(hào)途徑的研究與日俱增,其

5、重要性也十分明顯,然而迄今為止,國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)Notch1信號(hào)途徑在喉鱗狀細(xì)胞癌中作用的研究報(bào)道,因此作者提出疑問(wèn),是否Notch1信號(hào)途徑在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中也起著十分重要的作用?為了解決這個(gè)問(wèn)題,在本研究中,作者首先通過(guò)Real-time PCR、Western blotting以及免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)喉鱗狀細(xì)胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1的表達(dá),并分別分析Notch1和Hes1的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的臨

6、床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系,初步探討Notch1和Hes1在喉鱗狀細(xì)胞癌中的可能作用。進(jìn)一步,構(gòu)建Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notch intracellulardomain,NICD)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體,并篩選出穩(wěn)定表達(dá)NICD的Hep-2細(xì)胞株,通過(guò)半定量RT-PCR和Western blotting方法檢測(cè)Notch1和Hes1的表達(dá),接著通過(guò)綠色熒光蛋白觀(guān)察Notch1 NICD所表達(dá)的蛋白在Hep-2細(xì)胞中的定

7、位,從而探討外源的Notch1 NICD是否能激活Hep-2細(xì)胞中的Notch1信號(hào)途徑。最后,作者通過(guò)CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、Boyden chamber實(shí)驗(yàn)、半定量RT-PCR和Western blotting技術(shù)研究活化的Notch1信號(hào)途徑對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞的遷移能力的影響,并探討相關(guān)的分子機(jī)制。該研究旨在為以Notch1信號(hào)途徑為靶點(diǎn)的喉鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向治療提供可行性的臨床依據(jù)。
　　

8、 第一部分 Noteh1及其下游靶基因Hes1在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及其意義
　　 方法：
　　 (1)采用Real-time PCR方法檢測(cè)新鮮標(biāo)本喉鱗狀細(xì)胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 (2)采用Western blotting方法檢測(cè)新鮮標(biāo)本喉鱗狀細(xì)胞癌組織和聲帶息肉組織中Notch1和下游靶基因Hes1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。
　　 (

9、3)采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)67例喉鱗狀細(xì)胞癌組織和26例聲帶息肉組織中Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)。
　　 (4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:應(yīng)用SPSS13.0分析軟件,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,采用X2檢驗(yàn)、t檢驗(yàn)和方差分析。P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)Real-time PCR和 Western blotting的結(jié)果均顯示,Notch1和Hes1在聲帶息肉組織中的表

10、達(dá)均明顯高于喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)(P<0.05)。
　　 (2)Notch1蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì),部分見(jiàn)于細(xì)胞核,Hes1蛋白的表達(dá)主要定位于細(xì)胞核。聲帶息肉組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率顯著高于喉鱗狀細(xì)胞癌組織中Notch1和Hes1蛋白表達(dá)的陽(yáng)性率,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (3)Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌的組織學(xué)分化、腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P

11、<0.05),且分化程度越低,Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)越低。
　　 第二部分 Noteh1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建及功能初步研究
　　 方法：
　　 (1)Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(Notchl NICD)全長(zhǎng)的克隆及測(cè)序鑒定:用Trizol試劑從人胎盤(pán)組織中提取總RNA,然后合成cDNA第一鏈,以合成的cDNA為模板通過(guò)PCR擴(kuò)增Notch1胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域全長(zhǎng),并測(cè)序。
　　 (2)pCLXSN

12、-Notch1和 pEGFP-C1-NICD載體的構(gòu)建:將帶酶切位點(diǎn)的NICD片段分別和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN和綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1相連,構(gòu)建pCLXSN-Notch1和pEGFP-C1-NICD載體。
　　 (3)穩(wěn)定表達(dá)NICD的Hep-2細(xì)胞株的篩選:將病毒上清和polybrene混勻加入培養(yǎng)的Hep-2細(xì)胞中,利用G418(400μg/ml)的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng),直到篩選出穩(wěn)定表達(dá)有NICD的He

13、p-2細(xì)胞株。
　　 (4)穩(wěn)定表達(dá)株的鑒定:利用半定量RT-PCR和Western blotting技術(shù)檢測(cè)Notch1和下游靶基因Hes1 mRNAs和蛋白的相對(duì)表達(dá)。
　　 (5)利用熒光顯微鏡觀(guān)察轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-NICD載體后蛋白的定位及研究Notch1途徑在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2中的激活狀態(tài)。
　　 (6)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:半定量RT-PCR和Western blotting的結(jié)果應(yīng)用Gene T

14、ools進(jìn)行灰度值分析,上述實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-wayANOVA),P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)成功構(gòu)建了Notch1 NICD的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN-Notch1和綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體pEGFP-C1-NICD。
　

15、　 (2)通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pCLXSN-Notch1載體轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞系Hep-2,成功篩選出穩(wěn)定表達(dá)Notch1 NICD的喉鱗癌細(xì)胞株。
　　 (3)RT-PCR結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)Notch1 NICD的喉鱗癌細(xì)胞株的Notch1和Hes1 mRNAs的表達(dá)均明顯上調(diào)。
　　 (4)Western blotting結(jié)果表明,穩(wěn)定表達(dá)Notch1 NICD的喉鱗癌細(xì)胞株的Notch1和Hes1蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào)。

16、
　　 (5)NICD的引入能明顯提高Notch1信號(hào)途徑的下游靶基因Hes1 mRNA和蛋白的表達(dá)水平,提示外源性的NICD能夠激活Hep-2細(xì)胞中的Notch1信號(hào)途徑。
　　 (6)轉(zhuǎn)染NICD的綠色熒光蛋白載體后,能明顯見(jiàn)到綠色熒光主要在喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2的細(xì)胞核部分表達(dá),進(jìn)一步提示Notch1途徑處于激活狀態(tài)。
　　 第三部分上調(diào)Notch1對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研

17、究
　　 方法：
　　 (1)采用新型的CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分析激活的Notch1信號(hào)途徑對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 (2)運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)激活的Notch1信號(hào)途徑對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌Hep-2細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響。
　　 (3)采用Boyden chamber實(shí)驗(yàn)分析上調(diào)Notch1的表達(dá)對(duì)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞Hep-2細(xì)胞遷移能力的影響。
　　 (4)采用半定量RT-PCR

18、和Western blotting方法檢測(cè)與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞遷移相關(guān)基因表達(dá)的變化。
　　 (5)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:半定量RT-PCR和Western blotting的結(jié)果應(yīng)用Gene Tools進(jìn)行灰度值分析,上述實(shí)驗(yàn)均分別重復(fù)三次。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),多個(gè)樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析(One-way ANOVA),P<0.0

19、5表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)活化的Notch1信號(hào)途徑能明顯地抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的增殖。
　　 (2)活化的Notch1信號(hào)途徑能明顯地促使喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞靜止在G0/G1期,細(xì)胞周期相關(guān)基因cyclin D1,cyclin E和cdk2表達(dá)下調(diào)而p53表達(dá)上調(diào)。
　　 (3)活化的Notch1信號(hào)途徑能明顯誘導(dǎo)喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞發(fā)生凋

20、亡,細(xì)胞凋亡相關(guān)基因caspase-3和caspase-9表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)。
　　 (4)活化的Notch1信號(hào)途徑能降低喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞的遷移能力,細(xì)胞遷移相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達(dá)下調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)Notch1在喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著十分重要的作用。
　　 (2)Notch1的過(guò)表達(dá)能明顯促使細(xì)胞周期靜止、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及抑制