ATF4轉(zhuǎn)錄活化SIRT1的分子機制及其在介導胃癌多藥耐藥中的作用.pdf

1、【背景】
　　多藥耐藥(MDR)通常是導致包括胃癌在內(nèi)的腫瘤化療失敗最主要的原因之一。胃癌的MDR機制在本實驗室和其他地方已進行了較廣泛而深入的研究，盡管目前已發(fā)現(xiàn)一些重要的分子和信號通路，然而仍未能完全闡明MDR，提示其他分子或信號通路也可能參與了MDR的發(fā)生。
　　哺乳動物細胞在缺氧，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，氨基酸缺乏，以及氧化應激等應激信號影響下，真核轉(zhuǎn)錄起始因子2α單位(eIF2α)會被磷酸化激酶磷酸化，這一磷酸化事件則會引起迅

2、速的和全面的蛋白生物合成減少，同時一部分基因會發(fā)生表達的上調(diào)。這些上調(diào)的基因可以減輕應激所致的細胞損傷，而其中重要的一個基因就是ATF4。在目前關于ATF4的文獻中，盡管一部分研究發(fā)現(xiàn)ATF4在嚴重或過長時間應激的誘導下可發(fā)揮促凋亡作用，大量研究結(jié)果仍提示ATF4是一個重要的應激反應基因，其在調(diào)節(jié)細胞適應集合應激反應(ISR)的多種不利環(huán)境下發(fā)揮著重要的保護作用。近來，一部分研究報道ATF4在多種惡性腫瘤中高表達，并且能保護腫瘤細胞免于

3、多種應激以及化療藥物所致的損傷。這些保護作用潛在的機制包括誘導自噬，促進DNA損傷修復，以及上調(diào)細胞內(nèi)谷胱甘肽等。然而，關于ATF4在胃癌MDR中的作用尚未見相關報道。
　　【目的】
　　研究ATF4是否在胃癌MDR發(fā)生中發(fā)揮一定的作用以及其可能的分子機制。
　　【方法】
　　1.ATF4在胃癌MDR中的作用
　　1）用qPCR和Westernblot在胃癌親本細胞SGC7901及其相應的多藥耐藥株SGC7

4、901/ADR和SGC7901/VCR中檢測ATF4的mRNA和蛋白水平。2）用Addgene公司的PLKO.1-TRC病毒載體構建針對ATF4的特異性以及無關對照siRNA慢病毒，分別命名為LV-siATF4和LV-SCR；使用FUW-teto載體構建表達ATF4的慢病毒，其對照空載體慢病毒作為對照，分別命名為LV-ATF4和LV-Vector。3）通過慢病毒轉(zhuǎn)染相關胃癌細胞系，并使用puromycin或zeocin進行篩選，建立相應

5、的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系。4）用平板克隆形成實驗檢測LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR細胞系在順鉑(CDDP)作用下的集落形成能力。5）用MTT實驗檢測LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR細胞在體外對不同藥物的敏感性差異。6）用Hoechst3

6、3258染料核染色,DNA碎裂檢測(DNAfragmentationassay)，以及用Westernblot檢測剪切形式的caspase-3來檢測5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系以及其相應的親本細胞對CDDP誘導凋亡反應的差異。
　　2.ATF4對應激反應基因SIRT1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究
　　7）用qPCR和Westernblot在5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中檢測SIRT1的mRNA和蛋白水平。8）在5）中的幾種穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系以及其相應的親本細

7、胞中用Westernblot檢測MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表達。9）使用生物信息學軟件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1基因的5’端序列的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。10）化學合成約1.2kb的人SIRT1基因啟動子序列片段(-1100至+100bp)并將其克隆入pGL3-Basic質(zhì)粒的XhoI和HindIII酶切位點之間。11）用Luciferase報告基因?qū)嶒瀬頇z測ATF4對SIR

8、T1啟動子活性的影響。12）用ChIP實驗檢測ATF4對SIRT1啟動子的直接結(jié)合能力。13）使用定點突變實驗突變SIRT1啟動子報告基因質(zhì)粒上可能的ATF4結(jié)合位點并構建相應的點突變質(zhì)粒。14）使用Luciferase報告基因?qū)嶒灆z測潛在的ATF4結(jié)合位點突變后對ATF4激活SIRT1啟動子活性的影響。
　　3.SIRT1在ATF4誘導胃癌MDR發(fā)生中的作用研究。
　　15）對LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細胞

9、系分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關對照siRNA，之后用平板克隆形成實驗檢測在CDDP作用下的集落形成能力。16）對LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關對照siRNA，之后用MTT實驗檢測其在體外對不同藥物的敏感性差異。17）對LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞分別轉(zhuǎn)染SIRT1特異性或無關對照siRNA，用流式細胞術，Hoechst33258染料核染色,以及用Westernblot檢測剪切形式的cas

10、pase-3來檢測其對CDDP誘導凋亡反應的差異。18）在17）中的細胞中檢測MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表達。19）用MTT實驗檢測EX-527對于LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901的基礎毒性。20）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞預孵育24小時后，使用Westernblot檢測SIRT1,ATF4,MDR1,MRP,Bcl-2和Bax表達變化。21）

11、使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞預孵育24小時后，用MTT實驗檢測CDDP和5-FU對以上細胞的毒性。22）用MTT實驗檢測EX-527和不同濃度CDDP和5-FU對LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞增殖是否具有協(xié)同抑制作用。
　　【結(jié)果】
　　1.ATF4可促進胃癌多藥耐藥表型的發(fā)生并且阻斷ATF4表達可逆轉(zhuǎn)胃癌多藥耐藥細胞對化療藥物的抵抗
　　1）ATF4的mRNA和蛋白水平在

12、多藥耐藥株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中均明顯高于其親本細胞SGC7901。2）LV-siATF4和LV-SCR，以及LV-ATF4和LV-Vector等慢病毒載體均得以成功制備。3）成功建立了LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901和AGS細胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR細胞系。4）在SGC7901和AGS細胞系過表達ATF4后使得相應細胞

13、在CDDP作用下克隆數(shù)為空載體轉(zhuǎn)染組的近三倍；而在耐藥細胞株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中下調(diào)ATF4表達后則導致CDDP作用下克隆數(shù)較對照組減少兩到三倍。5）在SGC7901中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ATF4后，阿霉素(ADR)，長春新堿(VCR)，順鉑(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的IC50值均較空載體轉(zhuǎn)染組明顯升高。而在耐藥細胞株SGC7901/ADR中下調(diào)ATF4表達后，細胞對以上化療藥物的敏感性均較對照組明顯增強。6

14、）在一定濃度的CDDP孵育36小時后，用Hoechst33258染料核染色和DNAfragmentationassay檢測在SGC7901-ATF4和SGC7901/ADR-SCR中并未發(fā)現(xiàn)明顯的凋亡改變，而在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-siATF4細胞中發(fā)現(xiàn)了明顯的細胞核濃縮破裂和DNALadder形成等細胞凋亡表現(xiàn)。不僅如此，使用Westernblot在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-

15、siATF4細胞中較對照組更早地和更多地發(fā)現(xiàn)了剪切體形式的caspase-3的表達。
　　2.ATF4可轉(zhuǎn)錄激活應激反應基因SIRT1的表達
　　7）在SGC7901細胞中過表達ATF4后SIRT1的mRNA和蛋白水平均較對照組明顯升高；而在SGC7901/ADR中下調(diào)ATF4表達后SIRT1的mRNA和蛋白水平均較對照組明顯下降。8）ATF4表達高的細胞較相應的低表達ATF4的細胞中MDR1均相應高表達，且伴有升高的Bcl

16、-2/Bax比率，MRP的表達無明顯差異。9）使用在線生物信息學軟件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1啟動子序列以后，在-950至-600bp之間發(fā)現(xiàn)兩處ATF4的潛在結(jié)合位點。10）成功地合成了約1.2kb的人SIRT1基因啟動子序列片段(-1100至+100bp)并將其克隆入pGL3-Basic質(zhì)粒的XhoI和HindIII酶切位點之間。DNA測序證實了質(zhì)粒構建成功。11）Lucife

17、rase報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示ATF4可以顯著激活SIRT1基因啟動子活性并且這種效應具有劑量依賴性的特點。12）使用ChIP實驗在SGC7901-ATF4細胞中用ATF4抗體進行染色質(zhì)免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)SIRT1基因啟動子上的兩處ATF4結(jié)合位點的片段均呈現(xiàn)明顯富集現(xiàn)象。13）針對1.2kbSIRT1-pGL3-Basic質(zhì)粒上的ATF4潛在結(jié)合位點進行定點突變，成功構建了相應的點突變報告基因質(zhì)粒。14）Luciferase報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

18、提示突變?nèi)我粷撛诮Y(jié)合位點均可降低ATF4對SIRT1基因啟動子活性的激活能力，同時突變兩個結(jié)合位點則完全阻斷了ATF4對SIRT1基因啟動子活性的影響。
　　3.SIRT1在介導ATF4誘導的胃癌多藥耐藥中發(fā)揮了關鍵的作用
　　15）在SGC7901-ATF4和AGS-ATF4細胞中用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達后聯(lián)合使用CDDP可使平板克隆形成數(shù)目較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對照組下降40％以上。16）MTT實驗結(jié)果提示

19、用特異性siRNA下調(diào)SIRT1可使SGC7901-ATF4細胞對化療藥物的敏感性得到一定程度的恢復，而在轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對照組中未見藥物敏感性的改變。17）在CDDP作用下，流式細胞術和Hoechst33258核染色檢測均提示用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達的SGC7901-ATF4細胞的凋亡率較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對照組明顯升高。不僅如此，使用Westernblot實驗在前者中早在CDDP作用12h時便觀察到了剪切體形式

20、的caspase-3的表達，而在對照組中即使CDDP處理24h后亦未觀察到明顯的caspase-3的剪切體出現(xiàn)。18）Westernblot實驗在用特異性siRNA下調(diào)SIRT1表達的SGC7901-ATF4細胞中發(fā)現(xiàn)MDR1的表達較轉(zhuǎn)染非特異siRNA的對照組明顯減少，而MRP，Bcl-2和Bax的表達未見明顯改變。19）MTT實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度高至10μM的EX-527不僅沒有抑制LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細

21、胞的活性，反而輕度促進了兩種細胞數(shù)量的增長。20）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4和LV-Vector穩(wěn)轉(zhuǎn)的SGC7901細胞預孵育24小時后，Westernblot檢測結(jié)果顯示僅MDR1的蛋白水平出現(xiàn)與EX-527濃度負相關的變化，而SIRT1，ATF4，MRP，Bcl-2和Bax表達與EX-527濃度改變無明顯相關。21）使用不同濃度的EX-527與LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細胞預孵育24小時后，MTT實驗結(jié)果提示E

22、X-527可增強CDDP和5-FU對以上細胞的毒性并呈現(xiàn)濃度依賴性的特點。22）10μM的EX-527可有效協(xié)同不同濃度CDDP和5-FU對LV-ATF4穩(wěn)轉(zhuǎn)SGC7901細胞增殖的毒性作用。
　　【結(jié)論】
　　1.ATF4介導了胃癌細胞MDR表型的發(fā)生，將ATF4作為靶點為逆轉(zhuǎn)胃癌MDR提供了一個新的途徑。
　　2.ATF4通過了上調(diào)MDR1和Bcl-2/Bax比率等多種機制促進了胃癌細胞MDR表型的發(fā)生。