MICA介導(dǎo)DC與NK細(xì)胞相互作用的初步研究.pdf

1、NK細(xì)胞不僅直接殺傷腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞，還分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機(jī)體的獲得性免疫功能。樹突狀細(xì)胞(DC)是激活初始T細(xì)胞、啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答的重要抗原遞呈細(xì)胞。前期研究表明：NK細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞(DC)之間的對(duì)話(crosstalk)不僅影響天然免疫功能，還對(duì)獲得性免疫的形成及發(fā)展有深遠(yuǎn)的影響。DC激活NK細(xì)胞，并通過上調(diào)NK細(xì)胞的活性而增強(qiáng)其抗腫瘤作用。反之，活化的NK細(xì)胞促進(jìn)DC成熟，并誘導(dǎo)Th0細(xì)胞向Th1方向發(fā)展，從而增強(qiáng)機(jī)體的

2、免疫防御和免疫監(jiān)視功能。MHCⅠ類相關(guān)分子A(Major histocompatibility complex classⅠ chain-relatedprotein A，MICA)，是NK細(xì)胞活化性受體NKG2D的配體，MICA與NKG2D結(jié)合后激活NK細(xì)胞，發(fā)揮其細(xì)胞毒活性和分泌IFN-γ等細(xì)胞因子。盡管單核細(xì)胞表面無MICA的表達(dá)，胞漿內(nèi)卻存在MICA分子。因此，本文試圖研究MICA如何介導(dǎo)DC與NK細(xì)胞的相互作用，以及MICA參

3、與DC與NK細(xì)胞之間的對(duì)話是否與結(jié)腸癌的免疫逃逸有關(guān)，從而深入探討MICA參與腫瘤發(fā)病的機(jī)制。本研究分為三部分：
　　 第一部分：DC表達(dá)MICA對(duì)NK細(xì)胞活性的影響。
　　 目的：觀察單核細(xì)胞分化為DC時(shí)是否表達(dá)MICA，以及DC表達(dá)MICA后對(duì)NK細(xì)胞活性的影響。
　　 方法：首先分離正常個(gè)體和結(jié)腸癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，經(jīng)重組GM-CSF、IL-4誘導(dǎo)為未成熟DC(iDC)。然后分別用LPS、T

4、NF-α、CD40L、IL-15和IFN-α刺激成熟，流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)MICA在單核細(xì)胞、iDC以及成熟DC(mDC)細(xì)胞表面的表達(dá)。并觀察DC表達(dá)MICA后對(duì)NK細(xì)胞表達(dá)CD69、細(xì)胞毒活性和IFN-γ分泌的影響。最后分別利用重組NKG2D-Ig蛋白和IL-12抗體阻斷實(shí)驗(yàn)觀察對(duì)DC激活NK細(xì)胞的影響。
　　 結(jié)果：健康個(gè)體和結(jié)腸癌患者單核細(xì)胞均微量表達(dá)MICA，iDC表面MICA表達(dá)量均提高。與iDC相比，LPS、T

5、NF-α和CD40L刺激的mDC表面MICA表達(dá)無明顯變化，但I(xiàn)FN-α、IL-15可刺激健康個(gè)體的成熟DC上調(diào)表達(dá)MICA，卻不能促進(jìn)結(jié)腸癌患者的成熟DC上調(diào)MICA的表達(dá)。受IFN-α刺激成熟的DC促進(jìn)NK細(xì)胞表達(dá)CD69、分泌IFN-γ、殺傷K562細(xì)胞。在DC激活NK細(xì)胞的培養(yǎng)體系中加入NKG2D-Ig蛋白可下調(diào)NK細(xì)胞毒活性和分泌IFN-γ，而加入IL-12抗體僅下調(diào)NK細(xì)胞分泌IFN-γ，對(duì)細(xì)胞毒功能無影響。
　　

6、結(jié)論：正常個(gè)體iDC和mDC細(xì)胞表面均表達(dá)MICA，IFN-α、IL-15刺激mDC上調(diào)MICA表達(dá)。DC表達(dá)MICA增強(qiáng)NK細(xì)NK活性，且其細(xì)胞毒活性的提高依賴于DC表面相關(guān)配體與NK細(xì)胞表面NKG2D的相互作用。結(jié)腸癌患者體內(nèi)mDC低表達(dá)MICA可能是其免疫逃逸的機(jī)制之一。
　　 第二部分：受MICA刺激的NK細(xì)胞對(duì)DC活性的影響。
　　 目的：觀察固相MICA(iMICA)是否協(xié)同NK細(xì)胞對(duì)iDC的作用，以及受NK

7、細(xì)胞攻擊的MICA陽性靶細(xì)胞是否促進(jìn)DC吞噬。
　　 方法：首先分別取異體新鮮分離的NK細(xì)胞、或受固相MICA刺激的異體NK細(xì)胞，以及IL-2、或IL-2聯(lián)合iMICA刺激的自體NK細(xì)胞與iDC按5∶1孵育，24小時(shí)后FCM分析CD86或HLA-DR陽性細(xì)胞頻率。其次取自體NK細(xì)胞以IL-2、或IL-2聯(lián)合iMICA刺激后按1∶5比例與iDC孵育，24小時(shí)后FCM檢測(cè)HLA-DR分子的表達(dá)變化，并通過IFN-γ抗體阻斷實(shí)驗(yàn)觀察i

8、MICA刺激的NK細(xì)胞是否通過分泌IFN-γ促進(jìn)DC成熟。最后分別將受LAK細(xì)胞攻擊的、或絲裂霉素C處理的CFSE標(biāo)記的K562、K562-MICA細(xì)胞，與iDC作用24小時(shí)后FCM檢測(cè)HLA-DR與CFSE雙陽性細(xì)胞頻率。
　　 結(jié)果：當(dāng)NK與iDC孵育比例為5∶1時(shí)，同種異體新鮮NK細(xì)胞及自體活化NK細(xì)胞均能殺傷iDC，而固相MICA無協(xié)同作用。當(dāng)NK與iDC孵育比例為1∶5時(shí)，固相MICA協(xié)同自體NK細(xì)胞誘導(dǎo)iDC成熟，而

9、加入IFN-γ抗體可以下調(diào)DC表達(dá)HLA-DR。當(dāng)K562、K562-MICA細(xì)胞受LAK細(xì)胞攻擊或絲裂霉素C處理后，K562-MICA細(xì)胞易被DC吞噬。
　　 結(jié)論：當(dāng)IL-2活化的NK細(xì)胞殺傷iDC時(shí)，無需iMICA刺激。但固相MICA可以刺激NK細(xì)胞分泌IFN-γ促進(jìn)DC成熟。MICA陽性的腫瘤細(xì)胞被NK細(xì)胞攻擊后促進(jìn)iDC吞噬。
　　 第三部分：結(jié)腸癌患者外周血單核細(xì)胞MICA表達(dá)與NK細(xì)胞相關(guān)表型的關(guān)聯(lián)分析。<

10、br>　　 目的：比較結(jié)腸癌患者與健康個(gè)體外周血MICA表達(dá)的單核細(xì)胞頻率，以及NKG2D、CD16、CD69陽性NK細(xì)胞頻率的差異，并探討體內(nèi)單核細(xì)胞MICA表達(dá)與NK活性相關(guān)受體的表達(dá)是否存在關(guān)聯(lián)。
　　 方法：取結(jié)腸癌患者以及健康個(gè)體外周血，常規(guī)分離PBMC，用不同顏色熒光單克隆抗體分別標(biāo)記CD14/MICA，CD56/NKG2D，CD56/CD69，CD56/CD16，流式細(xì)胞儀分析雙陽性細(xì)胞頻率。利用直線相關(guān)回歸分析

11、單核細(xì)胞MICA表達(dá)頻率與NK表達(dá)NKG2D及CD69頻率的關(guān)聯(lián)性。
　　 結(jié)果：結(jié)腸癌患者與健康個(gè)體外周血CD14+/MICA+單核細(xì)胞頻率無明顯差異。結(jié)腸癌患者CD56+/NKG2D+細(xì)胞，CD56+/CD69+細(xì)胞頻率與健康個(gè)體相比明顯下調(diào)，但CD56+/CD16+細(xì)胞頻率無差異。另外，單核細(xì)胞MICA的表達(dá)與NK細(xì)胞NKG2D及CD69的表達(dá)無明顯關(guān)聯(lián)。
　　 結(jié)論：結(jié)腸癌患者與健康個(gè)體外周血MICA陽性的單核細(xì)