彌漫大B細胞淋巴瘤細胞株SUDHL2中CD44ICD存在的意義及其作用機理的初步探討.pdf

1、研究背景：
　　 彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuselargeB-celllymphoma,DLBCL)是非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin'slymphoma，NHL)中最常見的類型之一，占成人淋巴瘤的30％-40％。據(jù)不完全統(tǒng)計，中國的發(fā)病率更高，約占56％，并且發(fā)病率逐年上升。DLBCL具有一定的侵襲性并且高度異質(zhì)，在臨床中予標準的CHOP或是R-CHOP化療，也只能使大約一半的病人獲得完全緩解，因此如何提高難治復(fù)發(fā)性

2、DLBCL的緩解率是臨床工作中面臨的巨大挑戰(zhàn)。國際預(yù)后指數(shù)(InternationalPrognosticIndexIPI)是臨床工作中普遍采用的預(yù)后指標，但是因DLBCL的高度異質(zhì)性，使IPI評分難以對其預(yù)后做出準確判斷。目前普遍采取的分型是通過cDNA微陣列和寡核苷酸技術(shù)，對比未激活B細胞、體外激活B細胞以及正常生發(fā)中心B細胞的基因表達圖譜做出的分型:生發(fā)中心B細胞樣(germinalcenterB-cell-like，GCB)和活

3、化B細胞樣(activated-B-ceil-like，ABC)和第三型。其中GCB型化療效果好，患者預(yù)后佳，ABC型對化療反映敏感度欠佳，預(yù)后差。
　　 研究表明腫瘤細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移與細胞表面的粘附分子密切相關(guān)。CD44是一種跨膜型粘附分子，廣泛表達與正常細胞和腫瘤細胞表面，參與腫瘤細胞的分化、生長、凋亡等調(diào)控。我們前期的研究也證明，CD44與DLBCL預(yù)后密切相關(guān)。CD44H或CD44v6表達的DLBCL患者預(yù)后差。CD4

4、4由信號肽、N-末端細胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和C-末端胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)域四個功能區(qū)組成，分子大小為80-90KD。CD44分子的跨膜段含有兩個早老因子依賴的酶切位點，近胞漿一側(cè)的位點水解脫落，形成大約12-16KD的CD44胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(CD44intracellulardomain，CD44ICD)，隨后可進入細胞核內(nèi)，激活核轉(zhuǎn)錄因子kappa-B(nucleartranscriptionfactorκB)等，進行轉(zhuǎn)錄調(diào)控。
　　 細

5、胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularregulatedproteinkinases，ERK)包括ERK1和ERK2，統(tǒng)稱為ERK1/2，相對分子量分別為42KD和44KD，是脯氨酸導(dǎo)向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，使脯氨酸相鄰的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化。是有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族成員之一。當其被激活發(fā)生磷酸化后，進入細胞核作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，促進某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達

6、。過度活化的ERK1/2與腫瘤的發(fā)生有關(guān)。
　　 Notch受體蛋白是由Notch基因編碼的一種跨膜蛋白，由胞外段、跨膜區(qū)和胞內(nèi)段組成。哺乳動物中存在4種Notch受體:Notch1-4。當配體與Notch受體結(jié)合后，能夠產(chǎn)生兩次蛋白水解反應(yīng)。當γ-分泌酶作用其跨膜區(qū)時，發(fā)生第二次水解反映，釋放出游離的Notch蛋白包內(nèi)段(NICD)。NICD穿過核膜進入細胞核，通過與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控細胞的增殖、分化、凋亡等。有文獻報道如果使

7、Notch-1受體表達下調(diào)，可以使NF-κB及其靶基因失活，抑制腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，促進其凋亡。
　　 DAPT是一種人工合成的γ-分泌酶抑制劑，是目前公認的Notch受體抑制劑，能有效抑制其水解，阻斷其信號通路，從而影響細胞的增殖、分化與凋亡。同時DAPT也能抑制CD44水解出CD44ICD，進而影響相關(guān)信號通路。我們前期的試驗表明，當加入10uM的DAPT后，CD44ICD和NF-κB的表達明顯受抑制，同時也有文獻報道，D

8、APT能使CD44的表達量下調(diào)，因此，我們并不能明確CD44陽性的ABC-DLBCL細胞株予DAPT處理后，NF-κB的下降究竟是何者引起:是因為CD44ICD的表達下降引起還是由于Notch信號通路被阻斷所引起。
　　 研究目的：
　　 利用現(xiàn)有的ABC-DLBCL細胞株，通過Westernblot的方法，明確各細胞株CD44ICD的細胞亞定位，進而觀察其對細胞凋亡的影響。并且探討DAPT、Notch信號通路和CD44

9、三者之間的關(guān)系，明確抑制CD44ICD的產(chǎn)生所產(chǎn)生的蛋白水平的改變，是Notch信號通路和CD44兩者之中的哪一個起主導(dǎo)作用，同時觀察CD44ICD被阻斷后，對細胞凋亡的影響，并為尋找提高DLBCL的緩解率的新方法做提供一些基礎(chǔ)資料。
　　 方法：
　　 1、細胞株:ABC-DLBCL細胞株SUDHL2、OCI-Ly3;
　　 2、檢測細胞表面CD44蛋白的表達:流式細胞儀檢測SUDHL2、OCI-Ly3細胞株中

10、CD44的表達情況;
　　 3、用不同濃的的DAPT分別處理兩株細胞，24、48、72h后，瑞氏-吉姆薩染色觀察細胞形態(tài)學(xué)的變化;流式細胞儀檢測CD44、CD19、CD20的表達情況;AnnexinV-FITC聯(lián)合PI染色檢測細胞凋亡情況，Real-timePCR檢測Notch-1、CD44ICD基因表達的變化;
　　 4、用不同濃度的DAPT處理CD44陽性的的細胞株1h后，檢測ERK1/2及磷酸化ERK1/2的表達情

11、況;
　　 5、所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析;計量資料采用X±S表示。如果數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用析因設(shè)計和One-WayANOVA進行分析，如果數(shù)據(jù)成偏態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。檢驗水準為α=0.05，雙側(cè)檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、CD44的表達水平流式細胞儀檢測兩細胞株SUDHL2、OCI-Ly3細胞表面CD44的表達，其表達水平分別為98.86％±1.56％、3.

12、66％±3.72％;
　　 2、Notch-1受體在Sudh12細胞株的表達在SUDHL2細胞株中可檢測到Notch-1受體的表達;
　　 3、DAPT對SUDHL2細胞株的形態(tài)及CD44、CD19、CD20表達的影響予0、0.1、1.0、5、10umol/L的DAPT分別作用SUDHL2細胞株，經(jīng)流式細胞儀檢測，不同濃度的DAPT對CD44(F=0.371，P=0.826)、CD19(F=0.164，P=0.954)、

13、CD20(F=0.049，P=0.995)抗原的表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;DAPT作用不同的時間，CD44(Z=-1.445，P=0.148)、CD19(Z=0.148，P=0.688)、CD20(F=2.494，P=0.130)抗原表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義;濃度和時間的交互相應(yīng)對三者的表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.371、0.164、0.049，P=0.826、0.954、0.995)。
　　 4、DAPT對CD44ICD、

14、和Notch-1基因表達的影響不同濃度的DAPT分別作用24h、48h、72h后，不同濃度的DAPT對CD44ICDmRNA(F=0.001，P=1.000)、Noteh-1mRNA(F=0.623，P=0.650)表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;DAPT作用不同的時間，CD44ICDmRNA(F=0.189，P=0.828)、Notch-1mRNA(F=2.830，P=0.73)表達量差異統(tǒng)計學(xué)意義，表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義;濃度和時間的交互

15、相應(yīng)對兩者的表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.002、0.368、0.049，P=1，000、0.926)
　　 5、DAPT對SUDHL2細胞凋亡的影響不同濃度的DAPT作用SUDHL2細胞后對細胞的凋亡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(F=1.747，P=0.166);不同時間點對SUDHL2細胞凋亡差異有無統(tǒng)計學(xué)意義((x)2=1.249，P=0.539));濃度與時間不存在交互效應(yīng)(F=0.801，P=0.607);
　　 6

16、、ERK1/2及磷酸化ERK1、2的檢測WesternBloting檢測SUDHL2細胞株中存在ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表達，予不同濃度的DAPT處理SUDHL2細胞1h后，ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表達量沒有明顯變化。
　　 結(jié)論：
　　 1、γ-分泌酶抑制劑DAPT不能抑制SUDHL2細胞株中CD44的表達，并且對CD19、CD20的表達量無影響，對SUDHL2細胞株形態(tài)無明顯改變。