專一性脫硫菌LY822的分離篩選及脫硫基因工程菌的構(gòu)建.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、專一性微生物脫硫技術(shù)能選擇地性脫除加氫脫硫技術(shù)難以脫除的芳香族含硫化合物,是實現(xiàn)石油及其產(chǎn)品深度脫硫有效的技術(shù)之一。分離篩選優(yōu)良的菌株,構(gòu)建高效的脫硫工程菌是提高微生物脫硫能力的重要途徑。本文以此為研究目標,開展了專一性脫硫菌株的分離鑒定、脫硫基因克隆、啟動子功能鑒定、表達載體和工程菌的構(gòu)建以及脫硫活性評估等方面的研究。 采用以二苯并噻吩(DBT)為唯一硫源的培養(yǎng)基,經(jīng)馴化培養(yǎng),從我國山東勝利油田土樣中分離到一株專一性脫硫菌株L

2、Y822。對該菌培養(yǎng)五天后的代謝產(chǎn)物高效液相色譜(HPLC)分析的結(jié)果表明,0.5mmol/L的DBT完全轉(zhuǎn)化為2-羥基聯(lián)苯(2-HBP),證明該菌株是“4S途徑”的專一性脫硫菌。菌株形態(tài)特征及16SrDNA序列分析表明,該菌屬于紅球菌屬進化分枝,與紅平紅球菌Rhodococcuserythropolis同源性最高,達到99.7%,故將該菌初步鑒定為Rhodococcussp.LY822。以LY822菌的質(zhì)粒DNA為模板,PCR反應(yīng)擴增

3、了三個脫硫結(jié)構(gòu)基因片段dszA、dszB和dszC,大小分別為1.3kb、1.0kb和1.2kb。利用表達質(zhì)粒pET21a分別克隆了三個脫硫基因,并在大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達,全細胞蛋白電泳分析發(fā)現(xiàn)有相應(yīng)的清晰融合蛋白條帶產(chǎn)生。 以帶有報告基因gfp的質(zhì)粒pEGH和大腸桿菌-紅球菌穿梭載體pBS305為出發(fā)質(zhì)粒,構(gòu)建了三個帶有不同啟動子的表達質(zhì)粒pBSGt、pBSGd和pBSGk,電擊轉(zhuǎn)化紅平紅球菌LY822。激光共

4、聚焦顯微鏡檢測結(jié)果表明,當(dāng)gfp基因受tsr(硫鏈絲菌肽抗性基因)啟動子調(diào)控時,gfp基因的表達效率最高,而且不再受硫酸鹽的抑制。 以紅平紅球菌LY822的質(zhì)粒為模板,擴增了脫硫基因的全片段,連接于經(jīng)HindⅢ-XbaⅠ酶切的pBSGd,pBSGk,pBSGt,得到帶有脫硫基因的表達載體pBSDd、pBSDt和pBSDk。分別電擊轉(zhuǎn)化LY822菌和吖啶橙消除質(zhì)粒的LY-0菌,脫硫活性測定結(jié)果表明,tsr啟動子調(diào)控的工程菌株LYD

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