中酸和生物素多克隆抗體的制備及其ELISA檢測方法的建立.pdf

1、背景：葉酸和生物素都屬于B族維生素，對維持機體的生理功能有重要作用。隨著食品工業(yè)的發(fā)展和人們對營養(yǎng)保健食品需求程度的曰漸提高，市場上出現(xiàn)了添加維生素的嬰兒配方食品、果汁和谷物產(chǎn)品等維生素強化食品。對于這些食品，必須控制其維生素含量。尤其對嬰幼兒食品和孕婦及乳母食品來說，維生素的定量分析在食品營養(yǎng)分析中占有重要地位。為保證食品標(biāo)簽標(biāo)注維生素含量的準(zhǔn)確性，美國FDA和European Directive2002/46/EC都制定了一系列法規(guī)

2、來檢測維生素強化食品中的維生素含量，我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T5009-2003、GB5413-2010也明確規(guī)定了對嬰幼兒食品和乳品中維生素含量的檢測。
　　 依據(jù)目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)，維生素分析方法有微生物法、高效液相色譜法和熒光法，方法比較單一，與實際需求有一定差距。微生物法操作繁瑣，耗時長；熒光分析法雖然靈敏度高，但其穩(wěn)定性和選擇性在某些樣品檢測中仍然有待提高；HPLC法具有穩(wěn)定、快速等優(yōu)點，但其缺點在于儀器設(shè)備昂貴，且樣品的前處

3、理較為復(fù)雜，不適合成分復(fù)雜、雜質(zhì)干擾大的樣品測定，難以用于現(xiàn)場操作。因此急需研究和建立一種高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟實用的維生素含量檢測方法。
　　 目的：酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA)能夠克服傳統(tǒng)方法的不足，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，非常適合作為食品安全分析技術(shù)，因此研究開發(fā)一種酶聯(lián)免疫分析法來檢測食品中葉酸和生物素的含量具有重要意義。
　　 方法：針對葉酸和生物素的結(jié)構(gòu)特點，我們利用EDC法和混合酸酐法合成了葉酸、生物素的免疫

4、原和包被抗原，用葉酸和生物素免疫原分別免疫新西蘭大白兔獲得其多克隆抗體。然后利用間接ELISA法測定葉酸和生物素抗體的效價、靈敏度、特異性等，以及考察了建立的間接ELISA法在實際樣品中的檢測限、準(zhǔn)確度和精密度等。
　　 結(jié)果：葉酸的ELISA檢測結(jié)果如下，在PBS緩沖液中的靈敏度IC50為15.5ng mL-1，最低檢測限IC10為3.0 ng mL-1，線性范圍為3～100 ng mL-1，相比于食品營養(yǎng)強化劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)G

5、B14880-94中規(guī)定的葉酸添加量(嬰幼兒食品380～700μg kg-1，孕婦、乳母專用食品2000～4000μg kg-1)，完全能夠滿足檢測的需求。特異性方面，除對蝶酸的交叉反應(yīng)率較高(145.3％)外，和其他藥物的交叉率均較小(<35.4％)。在牛奶、奶粉和飲料中的檢測限分別為11.91 ng mL-1，16.5 ng mL-1和3.52 ng mL-1，回收率均在88.39/0～108.9％范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小于16.3％。

6、
　　 生物素的ELISA檢測結(jié)果如下，在PBS緩沖液中的靈敏度IC50為8.5 ngmL-1，最低檢測限IC20為2.1 ng mL-1，線性范圍為1～100 ng mL-1，相比于GB14880-94中規(guī)定的生物素添加量(嬰幼兒食品0.10～0.40 mg kg-1，飲液0.02～0.08mg kg-1)，完全能夠滿足檢測的需求。在牛奶中的檢測限為4.03 ng mL-1，回收率均在78.2％～95.4％范圍內(nèi)，變異系數(shù)均小