豬喉軟骨硫酸軟骨素的制備和抗氧化、降血脂機(jī)理研究.pdf

1、硫酸軟骨素(ChS)是來源于動物的一類重要的糖胺聚糖，具有抗炎、抗癌、降血脂和抗氧化等功能。以往主要是通過氫氧化鈉-胰酶復(fù)合工藝來制備。本試驗(yàn)選擇木瓜蛋白酶單酶酶解工藝來提取ChS，對其進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)分析，研究ChS體外抗氧化特性，并以高脂日糧大鼠為試驗(yàn)動物，研究其抗氧化和降血脂機(jī)理。 分別用木瓜蛋白酶和氫氧化鈉-胰酶酶解工藝提取ChS，用三氯乙酸、DEAE-SepharoseFast Flow離子交換柱層析和Sephacr

2、yl S-300 HR凝膠柱層析進(jìn)行分離純化。初步比較了兩種方法提取的ChS的基本特征。結(jié)果顯示木瓜蛋白酶提取的ChS產(chǎn)品色澤潔白，平均相對分子質(zhì)量43569，分布系數(shù)為2.04，工藝簡單，提取率30.51±0.89％，重復(fù)性好，傳統(tǒng)工藝氫氧化鈉-胰酶提取的ChS產(chǎn)品色澤深，平均相對分子質(zhì)量25773，分布系數(shù)為3.15，工藝復(fù)雜，提取時間長，提取率21.23±1.65％。通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)，確定了木瓜蛋白酶提取ChS的最佳工藝：

3、溫度60℃，pH值6.0，木瓜蛋白酶濃度為0.7％，提取時間7 h。DEAE-Sepharose Fast．Flow離子交換柱層析和Sephacryl S-300 HR分離純化的ChS經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和高效凝膠排阻柱色譜鑒定為高純度的均一性大分子。 采用脂質(zhì)體過氧化體系、比色法和化學(xué)發(fā)光法研究ChS的體外抗氧化作用。結(jié)果顯示兩種方式提取的ChS對超氧陰離子自由基(O<,2><'->)和羥基自由基(-OH)具有明顯的清除作用，其中

4、木瓜蛋白酶提取ChS的O<,2><'->·和·OH清除效果好于氫氧化鈉．胰酶提取ChS，對于O<,2><'->，兩者的半數(shù)抑制濃度(IC<,50>)分別為(0.9±0.09)和(2.9±0.11)mg·mL<'-1>(p<0.01)，對于·OH，兩者的IC<,50>分別為(8.92±0.09)和(9.08±0.06)mg·mL<'-1> (p<0.01)。兩種方式提取的ChS對DPPH自由基、過氧化氫和脂質(zhì)體過氧化體系都沒有顯著作用。

5、 接著將ChS進(jìn)行羧基還原、脫硫和多硫酸化化學(xué)修飾，初步探討ChS是否與銅離子、發(fā)生配合作用、是否與O<,2><'-1>之間發(fā)生相互作用，同時利用生物化學(xué)發(fā)光、平衡透析、熒光分析、紅外光譜和熱分析等技術(shù)探討ChS修飾前后的體外·OH和O<,2><'->清除特性，探討發(fā)生反應(yīng)的可能基團(tuán)。結(jié)果顯示ChS經(jīng)碳二亞胺和氯磺酸分別還原和多硫酸化后，都沒有顯示出·OH清除活性，未經(jīng)修飾的ChS和脫硫后的ChS清除．OH的IC<,50>分別為(

6、8.90±0.16)mg·mL<'-1>和(5.65±0.31)mg·mL<'-1>。ChS在去離子水中具有銅離子配合作用，在酸性介質(zhì)中配合作用消失，在一定濃度范圍內(nèi)，ChS對Cu<'2+>的配合作用隨濃度的升高而升高，脫硫后的ChS對Cu<'2+>的配合作用極顯著高于未經(jīng)修飾的ChS，但是經(jīng)羧基還原和多硫酸化后的ChS對Cu<'2+>的配合作用都極顯著低于未經(jīng)修飾的ChS。ChS與銅形成配合物后，光譜學(xué)特征和熱穩(wěn)定性明顯改變，乙?；?/p>

7、紅外特征吸收頻率在反應(yīng)前后未改變，說明其沒有參與配位反應(yīng)，而羧基相反，結(jié)合熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，初步認(rèn)為是羧基而不是硫酸基與Cu<'2+>發(fā)生配合作用，阻斷·OH的產(chǎn)生；脫硫和還原后的ChS對O<,2><'->·清除活性極顯著低于未經(jīng)修飾的ChS，硫酸酯化后的ChS產(chǎn)品的O<,2><'->·清除活性強(qiáng)于未經(jīng)過修飾的ChS，但差異不顯著(p>0.05)。ChS與O<,2><'->·反應(yīng)后，紅外分析顯示歸屬于羧基和硫酸基伸縮振動的吸收峰(1418.

8、21 cm<'-1>和1230 cm<'-1>)明顯減弱，硫酸基軸向振動吸收峰(855 cm<'-1>)消失，并且出現(xiàn)兩個新的吸收峰(1451.52 cm<'-1>和869.48 cm<'-1>)；ChS與O<,2><'->·反應(yīng)后，熱穩(wěn)定性明顯改變，ChS在244.95℃-250.166℃發(fā)生分解，為放熱反應(yīng)。反應(yīng)后ChS放熱峰消失，在122.483℃-128.76℃和172.10℃-199.36℃范圍出現(xiàn)兩個吸熱峰，證實(shí)了ChS的羧

9、基和硫酸基確實(shí)與O<,2><'->·發(fā)生了化學(xué)反應(yīng)。 采用灌胃法探討ChS對高脂日糧大鼠的抗氧化作用。24只大鼠適應(yīng)環(huán)境后，根據(jù)空腹稱重隨機(jī)分為正常對照組(NC，正常飼料)，高脂模型組(HFD，高脂飼料)，ChS添加組1(Res 1，500 mg·kg<'-1>·d<'-1>)和ChS添加組2(Res 2，1000 mg·kg<'-1>·d<'-1>)，連續(xù)灌胃5周后測定血清和肝臟中MDA、T-AOC、SOD、GSH、CAT、C

10、P、MPO活性、·OH抑制能方和線粒體DNA氧化損傷程度。結(jié)果顯示：盡管高劑量組ChS沒有比低劑量組ChS有更明顯的抗氧化作用，但兩組ChS組都能顯著升高T-AOC和降低MDA含量，降低高脂日糧大鼠氧化應(yīng)激；顯著升高高脂日糧大鼠血清和組織中的內(nèi)源性抗氧化劑SOD、GSH、CAT和CP的活性；增強(qiáng)血清和肝臟的羥基自由基抑制能力；降低MPO活性和減輕線粒體的氧化損傷。恢復(fù)機(jī)體的氧化還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡，減少自由基的毒副作用，降低蛋白質(zhì)和核酸等

11、生物大分子的氧化損傷。 ChS對高脂日糧大鼠的降血脂作用結(jié)果顯示ChS顯著降低高脂日糧大鼠血清和肝臟TC、TG含量，并隨著劑量的增加而增加；升高血清和肝臟LPL和HL活性；顯著降低血清LDL-C含量；降低動脈粥樣硬化指數(shù)。低劑量ChS可顯著升高HDL-C含量，高劑量ChS卻相反，并且該組血清TC和TG含量顯著低于正常組。說明ChS過多也可能進(jìn)一步導(dǎo)致血脂代謝紊亂。 比色法、HPLC和GC證明ChS主要含葡萄糖醛酸、乙酰氨

12、基半乳糖、木糖和半乳糖組成，摩爾比分別為：32.92:32.14:1:1.39。紅外光譜分析表明ChS中含有6-硫酸化乙酰氨基半乳糖和4-硫酸化乙酰氨基半乳糖，結(jié)合ChS的ChS酶ABC裂解產(chǎn)物的瓊脂、糖凝膠電泳和HPLC分析，表明ChS為均一大分子，不含有其它硫酸角質(zhì)類糖胺聚糖分子。由比色法、HPLC、LC-MS、NMR(<'1>H NMR、<'13>C NMR、DEPT90、DEPT 135、H-H COSY和NOESY)譜進(jìn)一步推