肺炎鏈球菌血清型和毒力基因的核酸擴增檢測及對炎癥小體激活的研究.pdf

1、目的:
　　 1.針對肺炎鏈球菌的莢膜基因，設計引物序列，建立起準確、快速的血清分型新方法。
　　 2.了解肺炎鏈球菌各毒力基因的攜帶情況。
　　 3.研究肺炎鏈球菌（侵襲性與非侵襲性）刺激巨噬細胞后對炎癥小體激活的影響狀況。
　　 方法:
　　 1.收集溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院2012年1月至8月的痰液、膿液、血液、腦脊液、胸水等臨床標本，通過Optochin敏感試驗，膽汁溶菌試驗，經(jīng)VITEK2

2、 COMPACT型全自動細菌分析儀對收集的標本進行再驗證。
　　 2.采用連續(xù)多重PCR技術，分7個反應，對肺炎鏈球菌的莢膜進行血清分型。
　　 3.采用PCR方法對前4位的肺炎鏈球菌莢膜血清型(19F，6A/B，19A，23F)DNA進行三個毒力基因(psaA、ply、lytA)的檢測。
　　 4.培養(yǎng)THP-1細胞，經(jīng)100ng/ml濃度的PMA刺激轉(zhuǎn)化為巨噬細胞，計數(shù)至5.0×105/ml，吸取1.0ml巨

3、噬細胞加入到4個12孔細胞培養(yǎng)板中，再向其中加入100μl濃度為1.0McFarland的肺炎鏈球菌（侵襲性與非侵襲性）作為實驗組，100μl生理鹽水作為對照組，均置37℃5％～7％CO2孵箱中分別孵育0h、2h、4h和8h，吸出細胞懸液至EP管，4000rpm離心10min取上清液，用ELISA法檢測上清液中Caspase-1、IL-1β和IL-18的濃度。
　　 結果:
　　 1.收集的98株菌株均為肺炎鏈球菌，其中

4、侵襲性肺炎鏈球菌共6株，4株來自腦脊液，1株來自血液，1株來自胸水，其余的92株均為非侵襲性肺炎鏈球菌，都來自痰液。
　　 2.共檢出9種血清型，分別是19F，6A/B，19A，23F，15B，3F，14，1，15A，共85株，檢出率86.7％(85/98)，前3個反應檢出率為79.6％(78/98)，其中19F型檢出率38.8％(38/98)，6A/B型檢出率18.4％(18/98)，19A型檢出率11.2％(11/98)，2

5、3F型檢出率8.2％(8/98)，15B型檢出率4.1％(4/98)，3F型檢出率3.0％(3/98)，14型檢出率1.0％(1/98)，1型檢出率1.0％(1/98)，15A型檢出率1.0％(1/98)。
　　 3.前4種血清型(19F，6A/B，19A，23F)肺炎鏈球菌均100％攜帶psaA、ply、lytA毒力基鼠。
　　 4.經(jīng)PMA誘導的THP-1細胞由懸浮生長變?yōu)橘N壁生長。
　　 5.Caspase

6、-1、IL-1β、IL-18的濃度均隨時間的增加而呈現(xiàn)增高趨勢，侵襲性肺炎鏈球菌組、非侵襲性肺炎鏈球菌組與生理鹽水組在同一個時間點比較，侵襲組和非侵襲組的Caspase-1、IL-1β、IL-18的濃度均高于生理鹽水組的濃度(P＜0.05)，侵襲性組Caspase-1的濃度高于非侵襲性組的濃度(P＜0.05)，而IL-1β、IL-18的濃度在這兩組間沒有差異性(P＞0.05)。
　　 結論:
　　 1.本院肺炎鏈球菌血清