CRM197和shRNA-VCAM-1聯(lián)合應(yīng)用對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的抗腫瘤作用及其機制研究.pdf

1、前言：
　　膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(gliobastona multiforme，GBM)是膠質(zhì)瘤中最常見的類型，約占全部膠質(zhì)瘤的50-60％。近年來，隨著對基因組研究的深入，對與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子途徑的研究，以及針對特定的受體、關(guān)鍵基因或調(diào)控分子進行的膠質(zhì)瘤基因靶向治療帶來了新的希望。
　　交叉反應(yīng)物質(zhì)197(cross-reacting material197，CRM197)是一種白喉毒素的無毒突變體，它們能與細(xì)胞膜上特

2、定的白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor，DTR)即肝素結(jié)合表皮生長因子的膜結(jié)合前體(pro heparin-binding epidermal growthfactor，PROHB-EGF)結(jié)合。我們以前的研究表明，CRM197能夠增加血腦屏障(bloodbrain barrier，BBB)的通透性。CRM197可以作為載體蛋白把藥物靶向輸送到大腦。而應(yīng)用順鉑聯(lián)合CRM197化療能提高對U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞的

3、生長抑制和凋亡的影響，因此推斷CRM197可能對膠質(zhì)母細(xì)胞瘤也有潛在的治療作用。
　　VCAM-1(vascular cell adhesion molecule1，VCAM-1)是一種粘附分子，其在腫瘤的增殖、凋亡、血管發(fā)生以及細(xì)胞運動中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)VCAM-1阻滯抗體能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，因此抗VCAM-1有望成為膠質(zhì)瘤靶向基因治療的新靶點。磷脂酰肌醇3-激酶(phodphoinositide3-kinases

4、，PI3K)家族參與多種信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、存活和遷移等。研究證明，CRM197可以抑制PI3K/Akt信號通路的激活，引起細(xì)胞凋亡。本實驗的目的是驗證CRM197和shRNA-VCAM-1單獨以及聯(lián)合應(yīng)用對膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的影響，探討相關(guān)的分子機制，為治療腦膠質(zhì)瘤的治療提供新途徑。
　　實驗材料和方法：
　　一、實驗材料
　?。ㄒ唬嶒灱?xì)胞株
　　人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞株購自于南京凱基生物

5、科技有限公司。應(yīng)用RNA干擾沉默VCAM1后的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞株由中國醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物重點實驗室提供。
　?。ǘ┲饕噭?br>　　CRM197，CCK8，DMSO(美國SIGMA公司)，DMEM/F-12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）;胎牛血清（天津灝洋生物科技有限公司）;AnnexinⅤ/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技有限公司），羊抗Akt(1)/2多克隆抗體，兔抗p-Akt1/2/3(Ser473)多克隆抗體，

6、兔抗MMP2多克隆抗體，羊抗MMP9多克隆抗體，兔抗VCAM-1多克隆抗體，小鼠抗單克隆抗體，增強化學(xué)發(fā)光法試劑盒（美國Santacruz公司），兔抗山羊HRP標(biāo)記的IGg二抗，山羊抗兔HRP標(biāo)記的IGg二抗，山羊抗小鼠HRP標(biāo)記的IGg二抗（北京中山生物技術(shù)公司）。
　　（三）主要儀器
　　細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Forma scientific公司）;超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）;倒置顯微鏡（日本TMS公司）;紫外可見

7、光分光光度計（R本島津公司）;超聲粉碎機（德國DR.Hielscher公司）;臺式低溫超速離心機（德國Sigma公司）;BDFacscalibur流式細(xì)胞儀（美國Becton-Dickinson公司）;聚丙烯酰胺凝膠電泳2裝置（美國Bio-Rad公司）;轉(zhuǎn)印儀（北京市六一儀器廠）;LAS3000成像系統(tǒng)（日本Fujifilm公司）;凝膠成像分析軟件（江蘇捷達(dá)科技有限公司）;電子分析天平（德國Sartorius公司）;-80℃超低溫冰箱（

8、日本Sanyo公司）;恒溫震蕩水浴（哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）;旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。
　　二、實驗方法
　　（一）細(xì)胞培養(yǎng)
　?。ǘ嶒灧纸M
　　1、CRM197對U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　(1)對照組（相同濃度溶解藥物的溶劑）
　　(2)shRNA-VCAM-1 U87組
　　(3)CRM197(10μg/ml)組
　　(4)CRM197(10μg/m

9、l)+shRNA-VCAM-1組
　　2、驗證shRNA-VCAM-1的沉默效率
　　(1)Blank: U87細(xì)胞
　　(2)NC: U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒
　　(3)shRNA-VCAM-1:U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默VCAM-1質(zhì)粒
　　3、CRM197與shRNA-VCAM-1聯(lián)合應(yīng)用對U87細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響
　　(1) Control組:U87細(xì)胞
　　(2) shRNA-VCAM-

10、1組:U87細(xì)胞轉(zhuǎn)染沉默VCAM-1質(zhì)粒
　　(3) CRM197組:U87細(xì)胞+CRM197(10μg/ml)
　　(4) CRM197+shRNA-VCAM-1組:CRM197(10μg/ml)+轉(zhuǎn)染沉默VCAM-1質(zhì)粒的U87細(xì)胞
　?。ㄈ┘?xì)胞培養(yǎng)
　?。ㄋ模〤CK8法測定細(xì)胞增殖活性
　?。ㄎ澹〢nnexinⅤ-PE/7AAD檢測細(xì)胞凋亡
　?。﹦澓墼囼灱癟ranswell遷移實驗觀察細(xì)

11、胞遷移、侵襲能力
　?。ㄆ撸￤estern Blot方法檢測Akt、MMP2、MMP9、Caspase3、Caspase8、Caspase9的蛋白表達(dá)
　?。ò耍┙y(tǒng)計學(xué)處理
　　所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，組間比較采用單因素方差分析(Bonferroni檢驗)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)果：
　　一、驗證shRNA-VCAM

12、-1的沉默效率
　　與對照組相比，NC組的VCAM-1的mRNA表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)變化;與NC組相比，shRNA-VCAM-1轉(zhuǎn)染后VCAM-1的核酸及蛋白表達(dá)顯著降低，沉默效率達(dá)到65％。
　　二、CRM197與shRNA-VCAM-1單獨及聯(lián)合應(yīng)用抑制U87細(xì)胞的增殖
　　CRM197和shRNA-VCAM-1分別作用U87細(xì)胞0h、12h、24h、36h、48h后，應(yīng)用CCK8方法檢測兩者單用及聯(lián)合應(yīng)用對U87細(xì)胞

13、生長抑制率的影響。shRNA-VCAM-1，CRM197(濃度為10μg/ml)或CRM197+shRNA-VCAM-1分別以時間依賴方式抑制細(xì)胞生長。shRNA-VCAM-1抑制U87細(xì)胞的增殖呈時間依賴性而最大抑制效應(yīng)出現(xiàn)在48小時。CRM197抑制細(xì)胞生長，24h達(dá)到峰值，之后下降。CRM197+shRNA-VCAM-1組的高峰抑制時間同樣出現(xiàn)在24 h。與同時間點shRNA-VCAM-1組相比較，12h、24h、36h的CRM1

14、97組的抑制率顯著增高，與CRM197組相比較，CRM197+shRNA-VCAM-1的抑制率顯著增高。
　　三、CRM197與shRNA-VCAM-1單獨及聯(lián)合應(yīng)用促進U87細(xì)胞凋亡
　　CRM197和shRNA-VCAM-1組作用U87細(xì)胞24h后，應(yīng)用AnnexinⅤ-PE/7AAD雙標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡。對照組，shRNA-VCAM-1組，CRM197(濃度為10μg/ml的CRM197)組，CRM197+shRNA-

15、VCAM-1組的凋亡率（含壞死細(xì)胞）分別是4.73±2.13％，18.88±3.66％，21.61±4.23％，39.63±2.95％。與對照組相比，shRNA-VCAM-1組，CRM197組，CRM197+shRNA-VCAM-1組細(xì)胞凋亡率分別顯著增加;與shRNA-VCAM-1或CRM197組相比，CRM197+shRNA-VCAM-1組細(xì)胞凋亡率分別顯著增加。
　　四、CRM197與shRNA-VCAM-1單獨及聯(lián)合應(yīng)用抑

16、制U87細(xì)胞的遷移、侵襲
　　1、(1)濃度為10μg/ml的CRM197與shRNA-VCAM-1聯(lián)合作用于U87細(xì)胞，細(xì)胞劃痕試驗觀察對U87細(xì)胞遷移能力變化。shRNA-VCAM-1組、CRM197組和CRM197組+shRNA-VCAM-1組分別抑制了U87細(xì)胞的遷移能力，CRM197+shRNA-VCAM-1組效果更明顯。
　　(2)各組穿過Transwell小室的細(xì)胞個數(shù)分別是:Control組，93.67±2.

17、08;shRNA-VCAM-1組，76±1.00; CRM197組，67±2.65; CRM197+shRNA-VCAM-1組，43.33±1.53。而與Control組相比時，shRNA-VCAM-1組，CRM197組和CRM197+shRNA-VCAM-1組分別顯著降低了U87細(xì)胞遷移能力，與CRM197組或shRNA-VCAM-1組相比，CRM197+shRNA-VCAM-1分別顯著降低了U87細(xì)胞的遷移能力。
　　2、各組

18、穿過Transwell小室的細(xì)胞的個數(shù)分別是:Control組為73.67±2.08個，shRNA-VCAM-1組為61±1個，CRM197組為55±2.65個，CRM197+shRNA-VCAM-1組為39.12±1.53個。與Control組相比， shRNA-VCAM-1組、CRM197組和CRM197+shRNA-VCAM-1組分別顯著降低了U87細(xì)胞侵襲能力，與CRM197組和shRNA-VCAM-1組相比，CRM197+sh

19、RNA-VCAM-1組分別顯著降低了U87細(xì)胞的侵襲能力。
　　五、CRM197與shRNA-VCAM-1單獨及聯(lián)合應(yīng)用抑制U87細(xì)胞的MMP2、MMP9蛋白表達(dá)
　　與Control組相比，CRM197組、shRNA-VCAM-1組、CRM197+shRNA-VCAM-1組均分別顯著降低了MMP2蛋白的表達(dá)，與CRM197組或shRNA-VCAM-1組相比，CRM197+shRNA-VCAM-1組進一步顯著降低了MMP2蛋

20、白的表達(dá)。與Control組相比，CRM197組或shRNA-VCAM-1組，CRM197+shRNA-VCAM-1組均分別顯著降低了MMP9蛋白的表達(dá);與CRM197組或shRNA-VCAM-1組相比，CRM197+shRNA-VCAM-1組進一步顯著降低了MMP9蛋白的表達(dá)。
　　六、CRM197與shRNA-VCAM-1聯(lián)合應(yīng)用增加U87細(xì)胞中活化的Caspase3、8、9蛋白的表達(dá)
　　與Control組相比，shR

21、NA-VCAM-1，CRM197，CRM197+shRNA-VCAM-1組分別顯著增強cleaved Caspase3/proCaspase3，cleaved Caspase8/proCaspase8，cleaved Caspase9/proCaspase9蛋白的激活。與shRNA-VCAM-1組或CRM197組相比，CRM197+shRNA-VCAM-1組顯著增高了cleaved Caspase3/proCaspase3，cleave

22、d Caspase8/proCaspase8,cleaved Caspase9/proCaspase9表達(dá)。
　　七、CRM197與shRNA-VCAM-1單獨及聯(lián)合應(yīng)用顯著降低U87細(xì)胞p-Akt的蛋白表達(dá)
　　與Control組相比，shRNA-VCAM-1組，CRM197組，CRM197+ shRNA-VCAM-1組分別顯著抑制Akt蛋白的激活。與shRNA-VCAM-1組或CRM197組相比，CRM197+shRNA

23、-VCAM-1組分別顯著降低了p-Akt蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1、CRM197、shRNA-VCAM-1單獨應(yīng)用分別有抑制人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲，及促進細(xì)胞凋亡的作用，聯(lián)合應(yīng)用在抑制細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲及促進細(xì)胞凋亡上存在著協(xié)同作用。
　　2、CRM197聯(lián)合shRNA-VCAM-1在抑制U87細(xì)胞增殖、遷移、侵襲，以及促進U87細(xì)胞的凋亡作用存在的協(xié)同機制，與下調(diào)MMP2、MMP9、和p-Ak