犬去細胞喉支架兩種體外保存方法的對照研究.pdf

1、頭頸部腫瘤中喉癌是最常見的癌癥，且發(fā)病率逐年遞增。喉癌目前主要治療方案仍為部分喉或全喉切除術(shù)[1]，術(shù)后長期聲音嘶啞或者不能發(fā)音，并嚴重影響患者生活質(zhì)量。據(jù)統(tǒng)計每年大約有25萬的喉癌患者行喉全切除術(shù)[2]。喉全切除術(shù)后選擇的一個積極治療方案為喉移植。但是，到目前為止，人類歷史上僅有2例成功的喉移植被報道[3,4]。臨床上近年來在組織結(jié)構(gòu)器官移植上進步很大，并且在組織工程方面去細胞的支架已經(jīng)成功運用。在去細胞喉支架的方面，我科已經(jīng)完成了兔

2、和犬喉支架的灌注，并對這種支架的組織相容性、免疫原性、生物力學進行了檢測，為構(gòu)建去細胞同種異體喉軟骨支架提供了理論和實驗依據(jù)[5-9]。進行喉移植前去細胞喉支架需進行保存，以便為臨床受體的選擇創(chuàng)造時間。目前器官和軟骨保存臨床上常使用的方法有：冷凍保存、細胞培養(yǎng)液保存、器官保存液保存[10-14]。冷凍保存主要用于實質(zhì)器官的保存，缺點為保存時間短，如果保存軟骨，軟骨細胞易失活。細胞培養(yǎng)液是主要用在保存和培養(yǎng)細胞方面。器官保存液也主要用來保

3、存實質(zhì)器官，目前未見用于保存去細胞支架的報道。去細胞喉支架應該如何保存？保存時間能否延長？保存后喉支架的結(jié)構(gòu)能否起到支撐作用？軟骨細胞能否存活？本實驗比較了RPMI-1640培養(yǎng)基和HCA器官保存液兩種保存方法對犬去細胞喉支架的軟骨活性和軟骨性能的影響，探討去細胞喉支架保存的最佳方式和時間。
　　目的：
　　1.灌注法制備犬去細胞喉支架，探討灌注后犬去細胞喉支架的外形、組織學、軟骨細胞活性、生物力學的情況，并和兩種體外保存后

4、的支架進行比較。
　　2.通過對犬去細胞喉支架兩種體外保存方法的對比研究，明確哪種方法更適合犬去細胞喉支架的保存，為下一步喉支架臨床應用提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.制備犬去細胞喉支架及其形態(tài)學研究
　　通過環(huán)甲動脈持續(xù)灌注 SDS、TritonX-100、PBS離子型去污劑，制備犬去細胞喉支架。在去除喉黏膜、肌肉、韌帶內(nèi)可溶性基質(zhì)的同時，保留細胞外基質(zhì)和低免疫原性的軟骨細胞及完整的去細胞犬喉支架。制備完后

5、，行大體觀察、組織學觀察及軟骨活性檢測。
　　2.犬去細胞喉支架體外保存的研究
　　實驗組：將2組（各12只）犬去細胞喉支架分別放入RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)（A組）和HCA器官保存液內(nèi)（B組）進行保存，1周、2周、4周、6周后取材。對照組（C組）：將另9只去細胞喉支架作為空白對照。3組均行大體觀察、組織學檢查、軟骨細胞活性檢測和生物力學性能檢測的對比。
　　結(jié)果：
　　1.制備犬去細胞喉支架及其形態(tài)學研究

6、>　　大體觀察：犬去細胞喉支架結(jié)構(gòu)完整、顏色蒼白，觸之有彈性，按壓無變形。HE染色示：喉支架肌群去細胞完全，軟骨細胞良好填充于軟骨陷窩內(nèi)。PDA-PI雙熒光染色示：去細胞喉支架冰凍切片示軟骨細胞發(fā)出黃綠色熒光，軟骨陷窩內(nèi)軟骨細胞存活良好，結(jié)構(gòu)完整。
　　2.犬去細胞喉支架的體外保存的研究
　　將實驗組的2組犬去細胞喉支架保存4個時間段后取材進行檢測。A組保存2周時和B組保存6周時去細胞喉支架外形變形明顯，軟骨細胞失活，壓凹硬

7、度試驗硬度改變明顯。保存2周、4周A、B兩組組間甲狀軟骨厚度有明顯統(tǒng)計學意義（t1=3.92，P1＜0.01；t2=4.54，P2＜0.01）。在保存2周、4周時A、B兩組組間甲狀軟骨壓縮模量比較有明顯統(tǒng)計學意義（t1=3.36，P1＜0.01；t2=3.13，P2＜0.01）。B組保存4周時去細胞喉支架硬度、軟骨細胞活性和甲狀軟骨壓縮模量與對照組比較基本無明顯變化。
　　結(jié)論：
　　1.通過環(huán)甲動脈灌注能夠清除肌肉和黏膜的