二甲雙胍對乳腺癌4T1細胞體內外生長和轉移的影響及其機制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　第一部分：
　　實驗目的：
　　通過體外實驗,研究二甲雙胍對乳腺癌細胞增殖、凋亡及侵襲的影響;探討二甲雙胍在抗乳腺癌中可能的分子靶點及其相關信號通路,初步證實二甲雙胍的抗腫瘤作用。
　　實驗方法：
　　通過體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌4T1細胞,檢測不同濃度二甲雙胍對細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡及細胞遷移、侵襲能力的影響;采用免疫印跡試驗(WB)技術檢測二甲雙胍對細胞凋亡蛋白、細胞周期調控蛋白

2、、侵襲相關蛋白表達的影響及探究AMPK/mTOR通路在二甲雙胍抑制乳腺癌癌細胞生長現象中的作用。
　　實驗結果：
　　1.二甲雙胍抑制體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞增殖
　　MTT結果顯示二甲雙胍能夠抑制4T1細胞增殖(P<0.05),且具有濃度依賴性和時間依賴性;Compound C可以拮抗二甲雙胍對乳腺癌4T1細胞的增殖抑制作用。
　　2.二甲雙胍激活乳腺癌細胞中AMPK/mTOR通路,Compoud C可以減弱其作用

3、。
　　免疫印跡試驗(WB)檢測發(fā)現二甲雙胍作用乳腺癌細胞48小時后,細胞內AMPK蛋白磷酸化水平提高,而mTOR通路下游蛋白p70S6K蛋白的磷酸化水平下降,這種作用呈濃度依賴性;而Compound C可以拮抗二甲雙胍作用。
　　3.二甲雙胍抑制乳腺癌細胞克隆形成
　　二甲雙胍能夠抑制4T1細胞的克隆形成(P<0.05),表現出濃度依賴性,5mM的二甲雙胍作用時,4T1的克隆形成率僅為4.11％。
　　4.二甲

4、雙胍抑制乳腺癌細胞周期進行
　　流式細胞儀檢測發(fā)現二甲雙胍能夠抑制乳腺癌細胞從G0/G1期進入S期,從而阻止乳腺癌細胞周期的進行(P<0.05);免疫印跡試驗(WB)檢測發(fā)現二甲雙胍導致乳腺癌細胞中Cyclin D1表達量的降低,說明二甲雙胍抑制乳腺癌細胞增殖可能是通過下調Cyclin D1表達、阻止細胞從G0/G1期進入S期從而阻止細胞周期進行來實現。
　　5.二甲雙胍誘導乳腺癌細胞凋亡
　　通過Annexin V—

5、FITC/PI染色流式細胞儀檢測、DAPI染色熒光顯微鏡檢測及免疫印跡試驗(WB)檢測發(fā)現二甲雙胍能夠誘導乳腺癌細胞出現凋亡同乳腺癌細胞在二甲雙胍的作用下 Cleaved Caspase-3表達量升高,說明二甲雙胍能夠激活細胞凋亡蛋白Caspase-3,從而誘導乳腺癌細胞發(fā)生凋亡(P<0.05)。
　　6.二甲雙胍抑制乳腺癌細胞的侵襲及遷移
　　劃痕實驗發(fā)現二甲雙胍能夠使乳腺癌細胞遷移能力下降;通過Transwell結果發(fā)現

6、二甲雙胍能夠使乳腺癌細胞侵襲能力下降。免疫印跡試驗(WB)檢測發(fā)現二甲雙胍導致乳腺癌細胞中侵襲相關蛋白(MPP-2,MPP-9)表達量下降。
　　實驗結論：
　　1.二甲雙胍可以抑制乳腺癌4T1細胞的增殖,將4T1細胞阻滯于G0/G1期并誘導細胞凋亡;
　　2.二甲雙胍可能通過激活AMPK/mTOR信號通路抑制乳腺癌4T1細胞的增殖, Compound C可以拮抗二甲雙胍對乳腺癌4T1細胞的增殖抑制作用;
　　3

7、.二甲雙胍可以降低乳腺癌4T1細胞的遷移能力及侵襲性。
　　第二部分：
　　實驗目的：
　　通過建立晚期乳腺癌模型,進一步證實二甲雙胍的抗腫瘤作用,并初步探討其對晚期乳腺癌遠處轉移的影響,為二甲雙胍的抗腫瘤效應提供新的證據,同時給晚期乳腺癌的臨床治療提供新的思路和治療選擇。
　　實驗方法：
　　建立晚期乳腺癌BALB/C小鼠移植瘤模型,觀察二甲雙胍治療對BALB/C小鼠移植瘤生長及肺臟轉移的影響。釆用免疫組

8、化(IHC-F)方法檢測二甲雙胍對移植瘤中增殖細胞相關抗原(ki-67)及磷酸化 mTOR表達的影響。采用熒光 TUNEL檢測移植瘤中細胞凋亡的情況。采用免疫印跡試驗(WB)技術檢測二甲雙胍對移植瘤中AMPK蛋白磷酸化及侵襲相關蛋白表達的影響。采用ELISA法檢測荷瘤小鼠血清胰島素和IGF-1水平。
　　實驗結果：
　　1.二甲雙胍抑制乳腺癌移植瘤的生長。
　　通過游標卡尺及精密天平測量發(fā)現在BALB/C小鼠移植瘤模型

9、中,口服二甲雙胍治療后能顯著縮小BALB/C小鼠移植瘤體積(P<0.05)。通過免疫組化(IHC-F)檢測發(fā)現口服二甲雙胍治療后BALB/C小鼠移植瘤組織中的ki-67指數顯著降低(P<0.05), mTOR蛋白磷酸化表達量顯著下降。通過熒光TUNEL染色發(fā)現口服二甲雙胍治療后BALB/C小鼠移植瘤組織中細胞凋亡數顯著增加。
　　2.二甲雙胍抑制晚期乳腺癌的遠處臟器轉移。
　　通過免疫印跡試驗(WB)檢測發(fā)現口服二甲雙胍治療

10、后BALB/C小鼠移植瘤組織中腫瘤侵襲相關蛋白(MPP-2,MPP-9)表達量下降。通過計數BALB/C小鼠移植瘤模型中肺臟轉移瘤個數并結合其肺臟HE染色病理切片發(fā)現口服二甲雙胍治療后, BALB/C小鼠移植瘤模型中肺臟轉移個數顯著下降(P<0.05)。
　　實驗結論：
　　1.二甲雙胍能夠抑制4T1小鼠模型異位移植瘤的生長,其主要機制可能包括:將4T1細胞阻滯于G0/G1期、誘導細胞凋亡及激活AMPK/mTOR信號通路;<