牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽發(fā)酵控制、分離及功能研究.pdf

1、牛肉風(fēng)味強(qiáng)化肽(Beefy Meaty Peptide，BMP)最初是從牛肉的木瓜蛋白酶水解物中分離得到的一種八肽。經(jīng)過分析證明BMP是牛肉風(fēng)味的主要成分之一，與谷氨酸鈉具有較好的協(xié)同呈味作用，可以增強(qiáng)牛肉的風(fēng)味，并且具有良好的熱穩(wěn)定性，適合于食品工業(yè)生產(chǎn)的熱處理要求。本論文對畢赤酵母工程菌在搖瓶和發(fā)酵罐中表達(dá)牛肉風(fēng)味肽進(jìn)行優(yōu)化控制；對BMP的分離純化進(jìn)行研究，得到不同純度的BMP；對BMP超濾濃縮液進(jìn)行美拉德反應(yīng)的呈味配方優(yōu)化，本工作

2、為BMP的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。
　　 在搖瓶發(fā)酵工藝研究上，首先考察了基因劑量對BMP表達(dá)量的影響，得到4拷貝、8拷貝、12拷貝和16拷貝外源蛋白的表達(dá)量分別為10.6 mg/L、16.3 mg/L、22.9 mg/L和35.4 mg/L；在此基礎(chǔ)上，研究了畢赤酵母工程菌1682表達(dá)BMP時甲醇誘導(dǎo)的補(bǔ)加方法，結(jié)果表明遞增添加方式更有利于菌體的生長和外源蛋白的表達(dá)，即每天按1.0％、1.2％、1.4％和1.6％的比例補(bǔ)加甲醇可使蛋白表

3、達(dá)量較高。
　　 在發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)控制研究上，采用三步發(fā)酵法的策略誘導(dǎo)表達(dá)BMP，即甘油分批培養(yǎng)階段、甘油補(bǔ)料分批培養(yǎng)階段和甲醇補(bǔ)料培養(yǎng)階段。通過對甘油流加周期的優(yōu)化，結(jié)果表明以15 mL/L·h的速度流加甘油4h能夠達(dá)到合適的菌體密度并保持良好的生理狀態(tài)，有利于外源蛋白的高效表達(dá)；甲醇的流加基于溶氧控制，采用限制性流加甲醇策略，通過調(diào)節(jié)補(bǔ)料周期和脈沖，使甲醇的流加速率約等于消耗速率，從而將溶氧控制在10～4～25％之間。和非限

4、制性流加甲醇策略相比，其外源蛋白表達(dá)量提高了55.04％(達(dá)到645 mg/L)，誘導(dǎo)時間縮短24 h。
　　 BMP分離提取研究結(jié)果表明，硫酸銨鹽析無法使發(fā)酵液中的大部分蛋白析出，而采用中空纖維超濾分離方法截留分子量在6kDa～60kDa之間的蛋白，蛋白質(zhì)總回收率較高，達(dá)到60％。分別使用陰離子交換樹脂F(xiàn)PA53和DEAE52對BMP超濾濃縮液進(jìn)行細(xì)分，結(jié)果顯示，陰離子交換樹脂DEAE52能夠?qū)MP超濾濃縮液進(jìn)一步純化，得到

5、的目標(biāo)蛋白純度可達(dá)93％，而使用FPA53樹脂無法得到高純度目標(biāo)蛋白。
　　 在美拉德呈味反應(yīng)研究中，以BMP的超濾濃縮液為反應(yīng)基料，通過單因素實驗和品嘗實驗確定了最佳的呈味反應(yīng)配方為：牛肉風(fēng)味肽超濾濃縮液50 mL，水50 mL，木糖10.0 g，牛脂3.0 g，半胱氨酸1.5 g，牛磺酸2.3 g，硫胺素1.0 g，復(fù)合氨基酸0.7g，NaCl2.0 g。與牛肉湯和水分別取代BMP超濾液的對照組相比，BMP超濾濃縮液的美拉德