免疫介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型中血清和腦脊液氨基酸的測(cè)定.pdf

1、目的：肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophiclateralsclerosis，ALS)是一種選擇性累及上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的進(jìn)行性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，臨床表現(xiàn)為肌無力、肌萎縮，多在首次出現(xiàn)癥狀后3-5年內(nèi)死亡。目前該病的病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，其發(fā)病機(jī)制有多種假說，如：興奮毒作用、自身免疫異常、氧化應(yīng)激、神經(jīng)絲異常、神經(jīng)元凋亡以及線粒體功能障礙等。許多證據(jù)表明谷氨酸介導(dǎo)的興奮毒性作用是ALS發(fā)病的重要環(huán)節(jié)。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神

2、經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酸能神經(jīng)元過度激活及突觸間隙中的谷氨酸過多堆積均可通過激活谷氨酸受體對(duì)突觸后神經(jīng)元及其周圍組織造成興奮毒性。本試驗(yàn)應(yīng)用牛脊髓前角灰質(zhì)勻漿免疫豚鼠建立免疫介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型，通過測(cè)定模型中免疫組、正常對(duì)照組和免疫對(duì)照組間豚鼠血清與腦脊液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量來探討其發(fā)病機(jī)制。 方法：1免疫介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型的建立采用健康雄性4月齡白化病遠(yuǎn)交系美國Hartley豚鼠，隨機(jī)分為免疫組、免疫

3、對(duì)照組和正常對(duì)照組。免疫組用牛脊髓前角加入到PBS和福氏佐劑中做成勻漿，皮下十點(diǎn)注射。首次免疫應(yīng)用牛脊髓前角勻漿加完全福氏佐劑，其后每4周應(yīng)用牛脊髓前角勻漿加不完全福氏佐劑免疫，共免疫四次。免疫對(duì)照組：將PBS和福氏佐劑做成勻漿免疫豚鼠。正常對(duì)照組：用PBS皮下注射豚鼠。免疫后觀察豚鼠肢體活動(dòng)情況，進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)估。每周稱體重，每4周做肌電圖。當(dāng)豚鼠出現(xiàn)肢體無力時(shí)停止免疫，當(dāng)動(dòng)物不能翻身時(shí)取材，從眼內(nèi)眥或心臟抽血放入4℃冰箱，靜置過夜后

4、離心，抽取上清；從小腦延髓池抽取腦脊液。血清和腦脊液放入-70℃冰箱保存。ELISA檢測(cè)血清中IgG水平。取新鮮股直肌肌肉作肌活檢。用4％多聚甲醛-0.05％戊二醛-0.2％苦味酸固定液灌注后取脊髓頸、腰膨大后用相同的固定液后固定3天。頸、腰膨大做HE、甲苯胺藍(lán)染色觀察運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元數(shù)目、神經(jīng)元變性情況以及IgG免疫組化染色觀察脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)有無IgG沉積。 2免疫介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型中血清和腦脊液氨基酸含量的測(cè)定 應(yīng)

5、用高效液相色譜分析儀檢測(cè)正常對(duì)照組、免疫對(duì)照組與免疫組豚鼠血清和腦脊液中谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、γ-氨基丁酸含量，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。用t檢驗(yàn)分析不同組間四種氨基酸濃度。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果：1成功建立免疫介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷模型免疫組豚鼠9只出現(xiàn)肢體癱瘓，肌張力減低，體重減低，肌電圖表現(xiàn)為失神經(jīng)支配，頸、腰膨大示前角灰質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性，數(shù)量減少。肌肉活檢提示神經(jīng)源性肌萎縮，ELISA測(cè)定血清IgG水平增高。脊髓

6、免疫組化發(fā)現(xiàn)前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)IgG沉積。正常對(duì)照組和免疫對(duì)照組均未出現(xiàn)上述改變。 2以正常對(duì)照組豚鼠血清和腦脊液的四種氨基酸濃度作為基礎(chǔ)值，免疫對(duì)照組與正常對(duì)照組四種氨基酸均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，免疫組癱瘓豚鼠血清和腦脊液谷氨酸、天冬氨酸升高，甘氨酸、γ-氨基丁酸與正常豚鼠和免疫對(duì)照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別，P＞0.05。 結(jié)論：應(yīng)用牛脊髓前角灰質(zhì)勻漿免疫豚鼠，造成豚鼠肢體癱瘓，脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性、壞死，神經(jīng)元數(shù)量減少，從而成功建立了