血小板膜糖蛋白去唾液酸化效應與ITP一線治療療效關系的研究.pdf

1、研究背景：
　　原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）是一種臨床常見的出血性疾病，目前對難治性ITP的發(fā)病機制尚未明確，且無有效的治療方法。ITP雖不是血液系統(tǒng)惡性疾病，但對于反復出現(xiàn)血小板重度減低，療效不佳的患者來說，生存質量極差，而且死亡風險也是極大的。ITP病理生理機制是多方面的，至今仍未完全明晰，目前得到公認的是，絕大多數(shù)的 ITP的產(chǎn)生都是由體液免疫和細胞免疫共同介導的血小板破壞。ITP的一線治療藥物有糖皮質激素和靜脈注射免疫

2、球蛋白（IVIG），其產(chǎn)生治療作用的主要機理包括抑制自身抗體的產(chǎn)生，封閉Fc受體的信號傳導通路，抑制巨噬細胞的吞噬功能，促進巨核細胞產(chǎn)生血小板等，最終達到提升患者的血小板計數(shù)水平。近年不同的研究組均發(fā)現(xiàn)，對于抗GPIIb/IIIa抗體介導的ITP，應用糖皮質激素和IVIG的一線治療效果尚可，但是，若患者體內(nèi)存在抗GPIb-V-IX復合物抗體，治療上給予上述一線治療效果往往較差。在目前較為明確的血小板清除的Fc受體依賴途徑外，是否存在其他

3、的途徑導致血小板的清除呢？最新的體外及體內(nèi)的實驗研究確認了是存在非 FcR依賴的血小板清除途徑的。血小板膜上的糖蛋白在神經(jīng)氨酸酶作用下去唾液酸化而暴露乙酰葡糖胺及半乳糖等殘基，這些去唾液酸化后的血小板通過表面血管性血友病因子（VWF）受體復合物的聚集，改變了信號傳導，并結合到肝臟枯否氏細胞的MAC-1受體或肝細胞的去唾液酸糖蛋白受體（Ashwell-Morell受體），在肝臟枯否細胞和肝細胞內(nèi)清除，這不同于以往的血小板在脾臟清除的過程。

4、然而在 ITP患者體內(nèi)血小板的變化如何，是否也存在這種非Fc受體依賴的血小板清除途徑，導致一部分ITP患者應用常規(guī)的一線治療效果不佳，目前尚未得到證實。
　　研究目的：
　　本課題旨在研究：（1）比較ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化標記物雞冠刺桐凝集素（ECL)、蓖麻凝集素（RCA-1）的結合水平與正常人的差異，分析ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化的狀況；（2）血小板膜表面膜表面糖蛋白去唾液酸化效應與ITP一線治

5、療療效關系，間接為血小板清除的非Fc受體依賴途徑的存在提供依據(jù)，以利于進一步探索有效的治療方法；（3）研究抗GPIbα抗體與ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化相關性；（4）ITP與其他疾病對照組的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平的比較，探討在不同疾病中，去唾液酸化致血小板減少的發(fā)病機制存在的可能性。
　　研究方法：
　　1.自2013年3月至2015年1月收集安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院住院ITP患者作為研究對象，并以伴血小

6、板減少的初診風濕免疫系統(tǒng)疾病、骨髓增生異常綜合征（MDS）、再生障礙性貧血（AA）和急性髓系白血?。ˋML）患者作為其他疾病對照組，安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院體檢中心20例健康成年人作為正常對照組。
　　2.流式細胞術（FCM）分析
　　我們通過流式細胞儀檢測血小板表面ECL及RCA-1標記的情況確定其膜表面糖蛋白去唾液酸化水平，ITP患者、其他疾病對照組及正常對照組的血小板分別與ECL和RCA-1孵育后上機檢測，測得ECL及

7、RCA-1結合百分比為去唾液酸化水平。
　　3.改良單克隆抗體特異性俘獲血小板抗原法（MAIPA）分析檢測ITP患者主要抗體類型，包括抗GPⅡbⅢa及GPⅠbα特異性自身抗體，對ITP患者進行分類選擇。
　　4.患者治療方法：61例 ITP患者主要接受一線治療：首先地塞米松，劑量為40mg/d，3～5 d，不聯(lián)合或聯(lián)合大劑量靜脈丙種球蛋白，劑量為0.4 g·kg-1·d-1，3～5 d，后改為口服潑尼松，劑量為1mg·kg-

8、1·d-1，并據(jù)療效逐步減量，維持治療一個月以上，期間監(jiān)測血常規(guī)，觀察療效。療效的具體判斷標準為：①完全反應(CR)：治療后血小板數(shù)≥100×109/L且沒有出血；②有效(R)：治療后血小板數(shù)≥30×109/L，并且至少比基礎血小板數(shù)增加兩倍，且沒有出血；③無效(NR)：治療后血小板數(shù)<30×109/L或者血小板數(shù)增加不到基礎值的兩倍或者有出血。按療效對患者分成CR、R、NR三組。
　　研究結果：
　　1.正常人與 ITP患

9、者這兩組在性別、年齡上的差異無統(tǒng)計學意義（性別：?2=2.796，P=0.094；年齡：t=-0.352，P=0.726），但兩組血小板計數(shù)的差異有顯著的統(tǒng)計學意義，t=21.914，P<0.001，ITP患者的血小板水平是明顯減低的。
　　2.正常人及ITP患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平（ECL，RCA-1）的差異有著顯著的統(tǒng)計學意義（P<0.001），ITP患者血小板的膜表面糖蛋白去唾液酸化水平是明顯增高的。
　　

10、3.61例ITP患者按療效分成CR、R、NR三組，運用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法分析，上述三組 ECL、RCA-1水平的比較，差異具有顯著的統(tǒng)計學意義，P<0.01。血小板去唾液酸化水平與ITP一線治療療效的spearman相關系數(shù)分析提示二者是相關的，ECL（r=0.391，P=0.002），RCA-1（r=0.395，P=0.002），提示去唾液酸化的指標越高，療效越差。
　　4.因標本留置問題，本實驗中的61例

11、 ITP患者中僅29例患者進行了改良MAIPA方法檢測，對這29例ITP患者按照抗GPⅠbα抗體陽性組、抗GPⅡb/Ⅲa抗體單陽性組及雙抗體陰性組分為3組，運用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法分析，各組ECL及RCA-1的差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05。
　　5.其他疾病對照組患者血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平分析：風濕免疫系統(tǒng)疾病、MDS、AA和 AML其他疾病對照組的血小板膜表面糖蛋白去唾液酸化水平與正常對照組比較均

12、有不同程度的升高（P<0.05），而 AML組的去唾液酸化水平與正常對照組比較無顯著差異（P>0.05）。包括ITP在內(nèi)的五個疾病組之間去唾液酸化水平存在差異（P<0.05）。其中ITP、風濕病及MDS去唾液酸化水平均較高。
　　結論：
　　1.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平較正常人明顯升高；
　　2.ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平與一線治療療效相關，隨著ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平的提高，患

13、者的一線治療療效越差，肝臟內(nèi)的血小板破壞在 ITP的發(fā)病機制中占有重要地位，支持了 ITP患者血小板清除的非Fc受體依賴途徑，利于對患者病情的判斷，治療方案的考慮選擇，為應用神經(jīng)氨酸酶抑制劑治療ITP的提供了可能性；
　　3.由于進行抗GPⅠbα抗體與ITP患者血小板膜糖蛋白去唾液酸化相關性分析的病例數(shù)較少，各抗體分組的 ITP患者去唾液酸化水平無差異，但是在兩組去唾液酸化水平的統(tǒng)計圖上可以看到存在抗 GPⅠbα抗體組的去唾液酸化

14、水平有略高的趨勢，由于這組數(shù)據(jù)較少，抗GPⅠbα抗體與去唾液酸化水平以及最終一線治療療效的關系有待后續(xù)擴大樣本量進行研究。
　　4.風濕病組、MDS組、AA組的血小板膜糖蛋白去唾液酸化水平與正常對照組比較均有不同程度的升高，而AML組的去唾液酸化水平與正常對照組比較無顯著差異。ITP組的去唾液酸化水平與其他疾病對照組中的風濕病組、MDS組及AA組的去唾液酸化水平相當，與AL組比較存在差異，需要考慮風濕病、MDS及AA這三組疾病在血