Tn5轉座系統(tǒng)在運動發(fā)酵單胞菌中的應用.pdf

1、充分利用木質纖維素水解液中的所有糖源，是以木質纖維素為原料發(fā)酵燃料乙醇的一個關鍵因素。木糖是木質纖維素中最重要的五碳糖組分，也是自然界僅次于葡萄糖的第二大糖源，因此人們在開發(fā)能同時發(fā)酵葡萄糖和木糖生成乙醇的微生物菌種上做了很多工作。運動發(fā)酵單胞菌作為一種乙醇生產菌，可以通過ED途徑專一代謝葡萄糖、果糖、蔗糖作為碳源和能源，同時具有高乙醇得率，高乙醇耐受性等優(yōu)點，但是Z.mobilis的缺點是底物利用范圍較窄，僅限于葡萄糖、果糖和蔗糖，而

2、不能利用木糖。 在實驗室的前期工作中分別克隆了構建木糖代謝路徑需要的四個酶的基因，即xylA，xylB，talB和tktA基因，并將其整合至穿梭載體后轉化至Z.mobilisZM4中。本工作的目的就是利用Tn5轉座系統(tǒng)將木糖利用的相關基因整合至染色體上。為了利用抗性更加有效的篩選到轉化子，同時還整合了氯霉素抗性基因作為篩選標記。 首先構建了兩個中轉質粒pUC18NotI-Cm-XX和pUC18SfiI-TT，即將外源基因

3、首先整合到輔助質粒pUC18NotI與pUC18SfiI中，而后再利用Sfil，Notl兩個稀有酶切位點將外源基因整合至系統(tǒng)質粒pUT中，而后通過接合轉移的方法將重組質粒轉化入Z.mobilis ZM4中。由于pUT質粒上含有可以編碼轉座酶的tnp基因，在轉座酶的作用下，得到了外源基因轉座至Z.mobilis ZM4染色體中的轉化子。 對檢出的轉化子提取染色體基因組，經PCR驗證證明外源基因確實整合到了Z.mobilis ZM4