桑黃菌原生質(zhì)體誘變育種及發(fā)酵工藝條件的研究.pdf

1、桑黃(Phellinuslinteus)是近年來(lái)引起研究者廣泛關(guān)注的一種珍稀食藥用真菌，所含有的生物活性成分如多糖、蛋白和多酚等在抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降血糖等方面具有明顯的效果。本文擬采用原生質(zhì)體誘變技術(shù)，對(duì)野生桑黃菌PLW-Ⅱ進(jìn)行鈷-60輻照處理，篩選生長(zhǎng)性能優(yōu)良的菌株;進(jìn)而對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化;最后通過(guò)在25L發(fā)酵罐上開展放大試驗(yàn)，建立桑黃發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。
　　 主要研究?jī)?nèi)容和所得結(jié)論如下:
　　

2、 (1)采用原生質(zhì)體鈷-60輻照誘變方法，篩選桑黃發(fā)酵高產(chǎn)菌株。首先采用18SrDNA序列同源性分析法，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子遺傳學(xué)研究，鑒定野生桑黃菌株P(guān)LW-Ⅱ?yàn)榱烟隳緦涌拙≒hellinuslintenus）。采用酶解法制備桑黃原生質(zhì)體，再用鈷-60射線誘變?cè)|(zhì)體，計(jì)算誘變致死率，確定鈷-60誘變劑量為100Gy，此時(shí)誘變致死率為75％。按照100Gy的誘變劑量進(jìn)行誘變，篩選出平板中生長(zhǎng)速度較快的10株變異株，經(jīng)液體搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，篩選

3、3株變異株JU7、JU8和JU10，其菌絲體產(chǎn)量分別為9.9g/L、10.3g/L和9.5g/L，比出發(fā)菌株分別高出3.1g/L、3.5g/L和2.7g/L?？疾?株變異菌株的遺傳穩(wěn)定性，平板中連續(xù)傳代培養(yǎng)5次，同時(shí)進(jìn)行搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定液體發(fā)酵中菌絲生物量。實(shí)驗(yàn)表明，5次傳代培養(yǎng)中，JU8的菌體生物量保持在10.0～10.4g/L，遺傳穩(wěn)定性較好，因此選擇JU8作為后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)菌株。
　　 (2)以菌體量為指標(biāo)，利用單因素實(shí)驗(yàn)

4、和Box-Behnken3×3設(shè)計(jì)優(yōu)化桑黃PhellinuslinteusJU8深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，各因素對(duì)桑黃菌絲體量均存在顯著的相關(guān)性;優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:葡萄糖35.85g/L，麩皮16.52g/L，酵母膏3g/L，KH2PO41.0g/L，在此條件下，菌絲生物量可達(dá)16.26g/L。最適培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速160r/min，接種量15％，裝液量100mL/250mL，初始pH5.5，搖瓶

5、培養(yǎng)8天。25L發(fā)酵罐放大試驗(yàn)結(jié)果表明，在發(fā)酵體積18L，溫度30℃，通氣量0.8vvmin，攪拌速度160r/min的條件下，發(fā)酵培養(yǎng)8d，菌體生物量可達(dá)18.8±1.21g/L。
　　 (3)在25L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批發(fā)酵試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中的桑黃菌體生物量、胞外多糖產(chǎn)量和殘?zhí)窍牧浚⒘松｜SPhellinuslinteusJU8分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。根據(jù)菌株在25L發(fā)酵罐分批發(fā)酵過(guò)程中所表現(xiàn)出來(lái)的菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物