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1、釀酒酵母五條MAP激酶信號(hào)通路間存在重要的交互作用。AFR1p對(duì)信息素信號(hào)通路和細(xì)胞壁完整性信號(hào)通路都具有調(diào)節(jié)作用,而且AFR1p也能影響細(xì)胞形態(tài)檢驗(yàn)點(diǎn)。對(duì)其作用機(jī)制的研究有助于解決相關(guān)領(lǐng)域的關(guān)鍵問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)主要研究Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株合成致死現(xiàn)象及合成致死機(jī)理。
本研究構(gòu)建了pUC18-RYu-E-Gal1p-Afr1p-Afr1質(zhì)粒并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母W303-A菌株
2、,通過(guò)同源重組將Gal1強(qiáng)啟動(dòng)子整合于酵母染色體AFR1基因位點(diǎn)上游,得到Gal1p-AFR1菌株。接著將Gal1p-AFR1菌株分別與mpk1Δ菌株和mih1Δ菌株交配并通過(guò)四分體拆分得到Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株。通過(guò)對(duì)菌株形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn),半乳糖誘導(dǎo)AFR1過(guò)量表達(dá)時(shí),缺失MIH1基因會(huì)使芽的極化程度進(jìn)一步加強(qiáng)。采用稀釋涂板的方法研究Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株與Gal1p-A
3、FR1-mih1Δ菌株的合成致死表型。Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株在YPGal平板無(wú)菌落長(zhǎng)出,說(shuō)明缺失MPK1與過(guò)量表達(dá)AFR1表現(xiàn)為合成致死,而且這種合成致死不能用低溫彌補(bǔ)。Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株在YPGal+1 M sorbitol平板上無(wú)菌落長(zhǎng)出。說(shuō)明過(guò)量表達(dá)AFR1與缺失MIH1在1M sorbitol存在下表現(xiàn)為合成致死。
通過(guò)研究致死菌株細(xì)胞壁的變化來(lái)探索其致死機(jī)理,測(cè)量了Gal1p-AF
4、R1-mpk1Δ菌株和Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株對(duì)蝸牛酶的敏感性。結(jié)果表明Gal1p-AFR1-mpk1Δ菌株與mpk1Δ菌株類似,都對(duì)蝸牛酶較敏感,但在致死條件下卻表現(xiàn)為敏感性的降低,說(shuō)明其合成致死與細(xì)胞壁成分變化沒有必然聯(lián)系。Gal1p-AFR1-mih1Δ菌株在致死條件下,細(xì)胞壁對(duì)蝸牛酶也沒有強(qiáng)的敏感性。說(shuō)明其有著復(fù)雜的致死機(jī)理。本研究還發(fā)現(xiàn),以半乳糖為碳源或是加入滲透壓支持劑,正常情況下都會(huì)使酵母細(xì)胞壁對(duì)蝸牛酶的抗性增
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