釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建與優(yōu)化.pdf

1、釀酒酵母是一種單細(xì)胞真核生物,但其具有與高等真核生物相同的許多基因、細(xì)胞器和功能。其分泌路徑在結(jié)構(gòu)和功能上與哺乳動物分泌系統(tǒng)的許多情況相似,包括蛋白折疊和降解的能力,糖基化和分泌蛋白的能力。釀酒酵母適合于表達(dá)科學(xué)和商業(yè)上有價值的異源蛋白。由于它不會產(chǎn)生出毒素成分,加之廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)的豐富經(jīng)驗已經(jīng)使得他成為生產(chǎn)藥物蛋白最優(yōu)的宿主菌。由釀酒酵母生產(chǎn)的一系列廣泛應(yīng)用于全世界的糖尿病治療的胰島素便是酵母在生物技術(shù)領(lǐng)域應(yīng)用的重要例子之一。然而

2、,目前國內(nèi)生產(chǎn)人胰島素的技術(shù)還相對落后,使得國產(chǎn)胰島素的生產(chǎn)成本遠(yuǎn)高于國際品牌。為了進(jìn)一步提高釀酒酵母的外源蛋白分泌效率,我們構(gòu)建了人胰島素及干擾素的酵母表達(dá)質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)化入釀酒酵母BJ5457菌株中,對蛋白表達(dá)條件進(jìn)行了探索性試驗。
　　首先,我們應(yīng)用重疊PCR方法構(gòu)建編碼人胰島素原類似分子的反轉(zhuǎn)錄DNA。通過表達(dá)編碼胰島素原類似分子的反轉(zhuǎn)錄DNA能夠使得折疊的單鏈胰島素原樣分子有效地分泌到培養(yǎng)上清中,這種胰島素原類似分子B鏈

3、第30個氨基酸蘇氨酸被去除,并與釀酒酵母a因子前導(dǎo)肽融合,后面接人胰島素原C肽替代物短肽(AAK)。被分泌的單鏈胰島素前體隨后可被純化和進(jìn)行后續(xù)的加工轉(zhuǎn)化成人胰島素。DNA序列分析顯示,編碼外分泌型胰島素的基因構(gòu)建成功。然后我們將胰島素原樣分子和蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的基因分別定向插入酵母表達(dá)質(zhì)粒YEp和pWX530中構(gòu)建分泌型重組表達(dá)載體YEp-PDI-Ins和WX530-PDI-Ins。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化釀酒酵母BJ5457感受態(tài)細(xì)胞,在亮氨酸

4、營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選含重組質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子菌落。對轉(zhuǎn)化子酵母進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),通過SDS-PAGE分析酵母培養(yǎng)液上清中的蛋白成分。含有重組表達(dá)質(zhì)粒的酵母轉(zhuǎn)化子可以在非誘導(dǎo)條件下表達(dá)外分泌型可溶性的胰島素蛋白,其分子量大小與預(yù)期大小相近。我們的實驗也表明過表達(dá)PDI,釀酒酵母的胰島素原樣分子的分泌效率有所提高。
　　采用分光光度計比濁法測定釀酒酵母BJ5457在選擇培養(yǎng)基YNB/Leu-中的生長曲線,確定菌體生長規(guī)律。結(jié)果表明,在酵母