擬除蟲菊酯噬菌體抗體庫構建及基因工程抗體制備.pdf

1、抗體作為免疫分析的核心試劑，其制備技術一直是制約免疫分析法在農藥殘留分析中應用的瓶頸因素，因此尋求一種新的抗體制備方法對農殘免疫分析具有重要的意義。
　　本研究利用噬菌體抗體庫技術和基因工程技術，制備了擬除蟲菊酯單鏈抗體，并對抗體的結構特點及其與抗原的特異性作用進行了分析。首先，從分泌擬除蟲菊酯單克隆抗體的雜交瘤細胞株2G2E7中提取總RNA，并反轉錄成cDNA。以cDNA為模板，利用兼并引物進行PCR擴增，獲得了長度約350 b

2、p的重鏈可變區(qū)基因和約325 bp的輕鏈可變區(qū)基因，再經重疊延伸PCR獲得了750 bp左右的單鏈抗體(scFv)基因。經過內切酶SfiⅠ和NotⅠ對scFv和pCANTAB5E載體進行酶切、連接和熱激法轉化大腸桿菌TG1，最終獲得了庫容大小2.3×107的擬除蟲菊酯初級抗體庫，陽性率為100％。利用抗原對抗體庫進行淘選，通過五輪淘選，有效地富集了擬除蟲菊酯特異性噬菌體抗體，第五輪淘選后的噬菌體陽性率為95％;隨機挑取五輪淘選后的單克隆

3、進行測序，得到3個scFv基因。將3個基因進行PCR擴增、EcoRⅠ和XhoⅠ酶切后，與pET-26b載體進行連接，成功構建重組表達載體scFv-pET26b。將重組質粒轉入表達菌株BL21，最終得到3個scFv-pET26b重組表達菌株。對表達條件進行優(yōu)化，經超聲破碎及SDS-PAGE檢測，結果顯示在0.1 mM IPTG，200 rpm，25℃低溫誘導12h條件下，3個scFv蛋白能成功表達，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于細胞內，

4、少量以可溶形式存在。利用間接競爭ELISA初步鑒定3個scFv的活性，結果表明:擬除蟲菊酯2號單鏈抗體(PBAscFv2)對氰戊菊酯具有一定的結合活性，10μg/mL標品濃度下抑制率約為20％。序列分析結果顯示PBAscFv2蛋白共245個氨基酸，重鏈123個氨基酸，輕鏈107個氨基酸，柔性連接肽15個氨基酸;經SOPMA軟件分析，PBAscFv2二級結構中含α螺旋21處，β折疊109處，β轉角23處，隨機卷曲92處;利用CPH mod

5、els3.2 Server對PBAscFv2的空間結構進行模擬，并利用DiscoveryStudio2.5軟件將PBAscFv2與氰戊菊酯分子進行對接，結果顯示抗原抗體結合區(qū)域由三部分構成:①抗體重鏈高可變區(qū)CDR3區(qū)(VH-CDR3)殘基Met106、Asp107、Tyr108和Trp109;②輕鏈框架Ⅲ區(qū)(VL-FR3)殘基Thr91和Ser92;③輕鏈高可變區(qū)CDR2區(qū)(VL-CDR2)殘基Ala41、Ser42和Pro43。