有機(jī)雙光子材料的合成及其在生物熒光探針和光聚合中的應(yīng)用.pdf

1、雙光子吸收過(guò)程具有長(zhǎng)波吸收短波發(fā)射、高度的三維空間選擇性及大穿透深度等不同于單光子吸收的特點(diǎn)。因此，有機(jī)雙光子材料及其應(yīng)用技術(shù)的研究引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的興趣，并取得了顯著的進(jìn)展。近年來(lái)，隨著雙光子熒光顯微鏡的商品化并成為生命科學(xué)家們的常用工具，雙光子生物熒光探針的研究成為一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域。與普適及共焦顯微鏡相比，雙光子熒光顯微鏡在三維成像方面分辨率高，生物樣品穿透深度大，并能有效避免光損傷。但雙光子熒光探針研究的相對(duì)滯后限制了雙光子

2、熒光顯微技術(shù)在生物學(xué)中的廣泛應(yīng)用。因此，尋求具有大的識(shí)別誘導(dǎo)雙光子熒光活性吸收截面、高熒光量子產(chǎn)率和靈敏的識(shí)別響應(yīng)性的雙光子熒光探針具有重要的理論和實(shí)踐意義。雙光子光聚合是有機(jī)雙光子材料應(yīng)用的另一個(gè)研究熱點(diǎn)，其具有高度空間選擇“點(diǎn)”聚合能力、長(zhǎng)波長(zhǎng)激光引發(fā)及輻照光的穿透性好等優(yōu)點(diǎn)，自1999年烯類單體的雙光子聚合被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，它在光開(kāi)關(guān)制備、光子晶體、微機(jī)械及三維微加工等前沿領(lǐng)域得到了廣泛的關(guān)注。對(duì)于雙光子聚合反應(yīng)，研究者們普遍認(rèn)為其機(jī)理

3、應(yīng)屬于自由基歷程，但并沒(méi)有得到有力的證實(shí)，因此，透徹了解雙光子光聚合機(jī)理對(duì)設(shè)計(jì)高效率的光聚合引發(fā)劑、提高聚合反應(yīng)的整體效率以及降低聚合反應(yīng)光強(qiáng)閾值等都具有重要意義。
　　 本論文利用Heck、Vilsmeier和Knoevenagel縮合等反應(yīng)合成了兩類生物熒光探針：以咔唑、吲哚和吡咯為母體，合成了五個(gè)具有良好水溶性及雙光子性能的呲啶鹽化合物作為DNA探針；將醛基引入到以咔唑?yàn)槟阁w的共軛體系中，制備了三個(gè)半胱氨酸探針。探針?lè)肿雍?/p>

4、成路線簡(jiǎn)單，易于操作。目標(biāo)分子通過(guò)核磁共振譜、元素分析及質(zhì)譜等手段進(jìn)行了表征。
　　 本論文詳細(xì)分析了化合物TMPC、THEPC、BMPI、BHEPI和BMPP在不同溶劑中的紫外吸收、單光子熒光光譜和雙光子熒光光譜，并計(jì)算了它們的量子產(chǎn)率Ф雙光子吸收截面δ和活性吸收截面Ф×δ，結(jié)果表明：TMPC、THEPC、BMPI和BHEPI在有機(jī)溶劑中的熒光性能遠(yuǎn)好于水中的性能，這意味著它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中熒光很弱，而與DNA結(jié)合后熒光增強(qiáng)，可能

5、成為“光開(kāi)關(guān)”型的DNA探針；雖然BMPP在水與有機(jī)溶劑中的熒光性能差別不大，但其熒光性能卻是最好的。
　　 通過(guò)ctDNA滴定實(shí)驗(yàn)，本文詳細(xì)地研究了TMPC、THEPC、BMPI、BHEPI和BMPP與DNA的作用。紫外吸收滴定表明，在ctDNA濃度較低時(shí)，分子與DNA的結(jié)合方式為嵌插結(jié)合，濃度高時(shí)為溝槽結(jié)合：在熒光滴定中，隨著ctDNA的加入，TMPC、THEPC、BMPI和BHEPI的熒光強(qiáng)度和峰位都有明顯的變化，其雙光子

6、熒光強(qiáng)度分別提升了22倍、34倍、43倍和50倍，而B(niǎo)MPP峰位無(wú)太大變化，強(qiáng)度提升了3倍；結(jié)合單光子熒光滴定與Scatchard公式得到了TMPC、THEPC、BMPI、BHEPI和BMPP與ctDNA的結(jié)合常數(shù)，分別為2.7×106 L·mol-1、5.79×106 L·mol-1、2.06×106 L·mol-1、2.26×106 L·mol-1和4.36×105L·mol-1；在740-800nm范圍內(nèi)，考察了不同激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)結(jié)合

7、DNA后探針的雙光子性能的影響，確定了它們的雙光子最佳激發(fā)波長(zhǎng)，TMPC與BHEPI為780 nm；THEPC、BMPI和BMPP為790nm；利用參比法計(jì)算了TMPC、THEPC、BMPI、BHEPI和BMPP結(jié)合ctDNA后的量子產(chǎn)率Ф雙光子吸收截面δ和活性吸收截面Ф×δ，其中Ф×δ分別為27.6、33.32、2.3、2.18和28.11 GM，均大于商品化的DNA探針DAPI(0.16GM)，與結(jié)合前相比，分別增大了14、25、3

8、4、37和3倍；五個(gè)分子結(jié)合DNA后都具有足夠好的光穩(wěn)定性。因此，五個(gè)分子都具有作為雙光子DNA探針的潛在應(yīng)用價(jià)值。對(duì)固定HeLa細(xì)胞的染色及成像結(jié)果表明：TMPC與THEPC能得到清晰的雙光子熒光圖像，可以精確地標(biāo)記細(xì)胞核，應(yīng)是一類有切實(shí)應(yīng)用價(jià)值的雙光子DNA熒光探針。
　　 本論文對(duì)半胱氨酸探針9E-PCAC、9E-ASCAC和9E-HSCAC的光譜性質(zhì)及其與半胱氨酸的作用進(jìn)行了初步探討。9E-PCAC、9E-ASCAC和9

9、E-HSCAC在苯、乙醇和水中的光譜性質(zhì)表明它們對(duì)環(huán)境有很好的敏感性，在不同溶劑中的熒光強(qiáng)度及量子產(chǎn)率差別很大。在乙醇溶液中，加入半胱氨酸后，9E-PCAC、9E-ASCAC和9E-HSCAC的熒光強(qiáng)度增大非常明顯，而在PBS緩沖液中基本沒(méi)有變化，這表明三個(gè)分子可能是環(huán)境敏感性及“光開(kāi)關(guān)”型的半胱氨酸探針。在乙醇中，9E-PCAC與半胱氨酸作用后，其最大吸收峰與最大熒光發(fā)射峰均紅移近100 nm，量子產(chǎn)率為8.23％，而且具有良好的雙光

10、子性能，雙光子吸收截面和活性吸收截面分別為227.55 GM和18.14 GM，因此，9E-PCAC可以通過(guò)峰位變化及熒光強(qiáng)度變化兩種手段來(lái)探測(cè)半胱氨酸。9E-ASCAC和9E-HSCAC結(jié)合半胱氨酸后，熒光峰位并沒(méi)有太大變化，但其熒光強(qiáng)度分別增大了42倍和120倍，它們會(huì)是理想的“光開(kāi)關(guān)”型單光子半胱氨酸探針。此外，三個(gè)分子對(duì)半胱氨酸都具有很好的專一識(shí)別性，不會(huì)受到其它氨基酸特別是高半胱氨酸和谷胱甘肽的影響?？疾炝松韕H值對(duì)三個(gè)分子

11、探針性能的影響：在pH=4-8范圍內(nèi)，pH值不會(huì)對(duì)其熒光性能產(chǎn)生太大影響，從而不會(huì)影響到其在生物細(xì)胞中的應(yīng)用。對(duì)HeLa細(xì)胞活染色及細(xì)胞內(nèi)熒光成像結(jié)果表明：三個(gè)分子都能進(jìn)入活細(xì)胞染色，并能實(shí)現(xiàn)寬場(chǎng)成像，且9E-PCAC能得到清晰的雙光子熒光成像，可以觀測(cè)半胱氨酸的分布情況。因此，9E-PCAC、9E-ASCAC和9E-HSCAC應(yīng)是具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的半胱氨酸探針，尤其是9E-PCAC，它在半胱氨酸雙光子生物成像方面將會(huì)有很好的應(yīng)用前景。

12、
　　 在雙光子光聚合方面，我們以已合成的雙光子材料DBMB為引發(fā)劑，利用20倍的超長(zhǎng)工作距離物鏡，通過(guò)精密移動(dòng)平臺(tái)在800nm激發(fā)下制作了周期間距在15-200μm之間的高周期間距微結(jié)構(gòu)。同時(shí)，我們對(duì)BDBAS/TMPTMA體系雙光子光聚合機(jī)理進(jìn)行了探討。利用ESR技術(shù)，我們?cè)贐DBAS/TMPTMA體系中實(shí)時(shí)捕捉到明確的自由基信號(hào)，首次證實(shí)了雙光子聚合的自由基機(jī)理。聚合體系的紫外吸收、單光子和雙光子熒光性質(zhì)表明BDBAS與T