乳源蛋白的ELISA檢測技術研究.pdf

1、針對乳品摻假的各種檢測方法的研究是控制乳品品質(zhì)的一個關鍵點，本課題針對牛乳中乳源蛋白，研究建立酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測技術。分別針對牛乳α-乳白蛋白(α-LA)和β-酪蛋白(β-CN)建立直接競爭法，及針對牛乳κ-酪蛋白(κ-CN)建立間接競爭法和間接法，通過檢測牛乳中乳源蛋白含量來分析牛乳中摻假情況。
　　 牛乳主要蛋白成分的分離制備：采用凝膠過濾色譜純化得到濃度為0.319mg/mL的α-LA，得率為9.27％；基于β

2、-及κ-CN等電點和對Ca2+敏感性的不同分離兩種蛋白，分離得到濃度為0.629mg/mL和1.808mg/mL的牛乳β-和κ-CN，得率分別為2.10％和6.03％。
　　 特異性IgG和IgY的制備與特性研究：以牛乳α-LA、β-及κ-CN分別免疫新西蘭大白兔，收集高效價血清，采用飽和硫酸銨分步鹽析和蛋白A親和色譜純化；用κ-CN免疫產(chǎn)蛋雞，收集高免雞蛋，采用水稀釋、膜微濾超濾、鹽析和親和色譜純化。得到純化α-LA-IgG，

3、β-CN-IgG，κ-CN-IgG及κ-CN-IgY樣品。蛋白含量分別為：0.574mg/mL，0.5014mg/mL，0.5144mg/mL及0.3944mg/mL。經(jīng)鹽析純化的IgG純度達70％，經(jīng)親和色譜純化的抗體IgG和IgY純度高達90％。
　　 牛乳蛋白抗原的酶標記技術研究：對抗原蛋白進行酶標記是建立直接競爭ELISA法的基礎，選用辣根過氧化物酶(HRP)應用過碘酸鈉氧化法對α-LA、β-及κ-CN分別進行標記，結果

4、顯示，HRP與α-LA的分子個數(shù)比為1.5:1，標記效果最佳（結合率22.2％，標記率66.7％）；β-CN的分子個數(shù)比為1:1時，標記效果最佳（結合率33.6％，標記率108.1％），所制得的酶標抗原的效價也較高均可達1:640。該法標記前兩種抗原的酶結合率及標記率等指標較為合適，而κ-CN的酶標記物各指標均較低（酶結合率均低于2.2％，標記率最高為66.2％）。
　　 牛乳蛋白檢測的ELISA方法是課題的重點，實驗了以下方法

5、：
　　 a、牛乳α-LA及β-CN抗原直接競爭ELISA法建立：確定了包被抗體最佳濃度（anti-α-LAIgG1:80及anti-β-CNIgG1:160）、封閉液體積及封閉時間（200μL，1％明膠，封閉1h）、酶標抗原稀釋度（HRP-α-LA1:20及HRP-β-CN1:10）和待測牛乳樣品稀釋度(1:10及1:40)、底物最佳反應時間(25min，37℃)等對競爭ELISA效果有重要影響的因素；
　　 b、牛乳

6、κ-CN抗原間接競爭ELISA法建立：確定了牛乳κ-CN抗原包被濃度為2.500μg/mL，4℃包被過夜，anti-κ-CN-IgG工作濃度為1:640（起始濃度為1mg/mL），原料乳待測樣品稀釋度為1:10240，抗體與待測樣品板外反應時間為30min;
　　 c、確定了應用anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY建立的間接ELISA免疫方法中，酶標羊抗兔IgG最佳稀釋度為1:2000，酶標兔抗雞IgG最佳稀釋

7、度為1:5000。κ-CN抗原包被濃度分別為1.563μg/mL,25.000μg/mL。anti-κ-CN-IgG及anti-κ-CN-IgY工作濃度均為1:10（起始濃度為1mg/mL），原料乳待測樣品稀釋度為1:3200；
　　 經(jīng)過重復性試驗及敏感性試驗表明，本課題建立的檢測牛乳α-LA及β-CN的直接競爭ELISA法對三聚氰胺的最低檢出限分別為5％及6％。建立的檢測牛乳κ-CN的間接競爭ELISA法的對三聚氰胺最低檢出