基于光子晶體顆粒的新型生物傳感器的制備和表征.pdf

1、最近，光子晶體被深入研究且廣泛應用于物理、化學以及生物等領域。光子晶體作為一類重要的先進光學材料，最重要的特征就是具有光子禁帶結(jié)構(gòu)，以及對光波的調(diào)制作用。利用這種特性，人們通過合成具有特殊功能的光子晶體材料，在光、熱、電場、磁場以及機械力等外界條件達到了對光子禁帶調(diào)制的作用。與此同時，光子禁帶的結(jié)構(gòu)受材料折射率的影響，而且還與晶格參數(shù)密不可分。就三維膠體光子晶體而言，其Bragg衍射峰位置與晶格常數(shù)成正比，因此任何引起材料整體折射率或是

2、晶格常數(shù)的改變都會引起光子禁帶位置的移動。當光子晶體中引入刺激響應性的凝膠作為骨架時，其會受到外界條件如pH、溫度、電場等的變化而產(chǎn)生強烈的體積膨脹、收縮。值得一提的是，利用凝膠這種膨脹、收縮的性質(zhì)，結(jié)合光子晶體技術(shù)，人們就可以制備出以凝膠為材料的光子晶體，這種凝膠光子晶體可以對外界刺激產(chǎn)生響應同時具有自表達的功能。由凝膠體積變化引起的結(jié)構(gòu)常數(shù)變化導致禁帶移動很大，光學特性的變化往往能夠直接通過肉眼觀察到。這樣就可以將化學信號轉(zhuǎn)化為可讀

3、的光學信號，甚至是顏色變化。目前為止，以凝膠為骨架的光子晶體已廣泛用作各類傳感器。據(jù)我們所知，鮮有報道將光子晶體應用于生物活體成像的研究。因此，對core-shell結(jié)構(gòu)的凝膠納米微球用于組裝成三維響應性的光子晶體顆粒的制備，以及用于生物活體成像的研究有待深入探討。
　　 本文主要圍繞響應性的光子晶體顆粒的制備，pH響應性的光子晶體顆粒用于Japanese medaka活體成像的研究，以及離子響應性的光子晶體用于淡水medaka

4、和海水medaka體內(nèi)離子分布成像的研究。具體的研究成果如下所述:
　　 1、用于自組裝成光子晶體顆粒的單分散性聚合微球的制備
　　 我們通過沸騰無皂乳液聚合制備了三種具有不同表面性質(zhì)的微球:聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，以及以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球。TEM圖表明，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，與以聚苯乙烯/聚丙烯

5、酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球都是core-shell結(jié)構(gòu)。與此同時，我們用這三種類型的微球制備出多分散性的光子晶體顆粒。SEM圖可以看出，光子晶體顆粒的單分散性很差，然而組裝成光子晶體顆粒的三種類型的微球都是單分散的，而且是呈正六邊形規(guī)整堆積。通過比較上述三種不同表面性質(zhì)微球的尺寸可以發(fā)現(xiàn)，隨著組裝成光子晶體顆粒的微球尺寸的增加，光子晶體顆粒的反射光譜會發(fā)生紅移。同時，為了探

6、討用三種不同表面性質(zhì)的微球組裝成的光子晶體顆粒的pH響應性，我們將光子晶體顆粒分別置于正十六烯和pH緩沖液中。通過反射光譜測試可知，由于在正十六烯和pH緩沖液中，其反射峰的位置基本上沒有改變，故可知聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，和毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球組裝成的光子晶體顆粒沒有pH響應性。然而，以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在正十六烯和一些列

7、的pH緩沖液中呈現(xiàn)出明顯的顏色改變，隨著pH的升高，肉眼可見顏色從正十六烯的紫色轉(zhuǎn)變?yōu)閜H11時候的明亮的綠色，且光子晶體顆粒響應的反射光譜會發(fā)生明顯的紅移從462nm移至560nm。
　　 為了驗證光子晶體顆粒pH響應的準確性，我們于25°測試了聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，毛發(fā)型聚苯乙烯/聚丙烯酸微球，以及以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球在相應pH下的動態(tài)

8、直徑Dz。結(jié)果表明，聚苯乙烯/聚丙烯酸微球載pH3時候的動態(tài)直徑Dz為209±2nm，當pH為7時，其動態(tài)直徑Dz基本上沒變?yōu)?08±3nm，故可知，當聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面未經(jīng)修飾時候，其不具備pH響應性。由此也可以解釋用聚苯乙烯/聚丙烯酸微球組裝成的光子晶體顆粒沒有pH響應的原因:單純依靠聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面的羧基官能團之間的排斥作用不足以改變微球之間堆積的間距。然而，當在聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面接枝毛發(fā)型的聚丙烯酸的高

9、分子鏈后，該毛發(fā)型微球有很好的pH響應性，其動態(tài)直徑Dz從pH3時的245±1nm增加到pH11時的300±3。這是由于隨著pH的升高，聚苯乙烯/聚丙烯酸微球表面的聚丙烯酸鏈段中的丙烯酸官能團去質(zhì)子化而使得聚丙烯酸鏈伸展，從而使得其動態(tài)直徑Dz增加，反之亦然。但是當pH升高到7以后，pH的增加僅僅使得體系鹽分的增高，故其動態(tài)直徑Dz會呈現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象。盡管毛發(fā)型微球有著很好的pH響應性，但是用其組裝成的光子晶體顆粒卻沒有pH響應性，推

10、測其可能性有兩個方面:第一是由于毛發(fā)型的聚丙烯酸鏈段未交聯(lián)，故其僅僅擁有水凝膠與水的混合能，而不具備由于水凝膠交聯(lián)而擁有的彈性能，因此僅僅依靠混合能難以改變光子晶體顆粒中微球的間距;第二可能是由于毛發(fā)型的微球不是如我們理想狀態(tài)的毛發(fā)結(jié)構(gòu)，而這一機理將有待于在接下來工作中深入探討和驗證。
　　 而以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球，由于在聚苯乙烯/聚丙烯酸微

11、球表面包裹上了一層交聯(lián)的聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠層，因此該微球有著很好的pH響應性。其動態(tài)直徑Dz從pH3時的210±3nm增加到pH11時的291±3nm，其pH響應的機理與毛發(fā)型微球的機理一樣，但是與毛發(fā)型微球比較可以看到，其動態(tài)直徑Dz隨著pH增加的改變趨勢要比毛發(fā)型的要舒緩得多，這是由于交聯(lián)水凝膠層使得其殼層具有一定的彈性效應的緣故。更重要的是，core-shell凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒也有著同樣靈敏的pH響應

12、效果，這是由于交聯(lián)的水凝膠殼層結(jié)構(gòu)使得這種網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)既具備由于水凝膠與水混合時候的混合能，同時也擁有由于交聯(lián)帶來的彈性能，使得光子晶體顆粒表面的凝膠微球在pH緩沖液中，隨著pH的改變使得水凝膠殼層的收縮或溶脹所帶來的凝膠微球間距的改變而導致Bragg衍射的改變，宏觀上體現(xiàn)為光子晶體顆粒顏色的改變。
　　 由此，讓我們受到啟發(fā)，通過引進不同的水凝膠單體，可以得到不同響應性的光子晶體顆粒;與此同時，由于微球表面修飾的是生物相容性的水凝

13、膠殼層結(jié)構(gòu)，和光子晶體顆粒隨外界環(huán)境改變時候肉眼可見的顏色改變，故啟發(fā)我們將其用于生物活體成像的研究。
　　 2、光子晶體顆粒用于活體成像分析Japanese medaka的腸胃形貌和pH狀況
　　 如前所述，我們利用沸騰無皂乳液聚合法制備了以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚丙烯酸/聚N-異丙基丙烯酰胺水凝膠為殼層結(jié)構(gòu)的core-shell凝膠微球，且已知道微球的大小對于組裝成光子晶體顆粒的Bragg衍射有很大影響:微球

14、尺寸增大會導致Bragg衍射紅移，而當微球尺寸減小時，Bragg衍射會藍移。為了獲得較大的顏色跨度，所以我們利用實驗中的配方來制備凝膠微球。與此同時，在種子共聚合過程中，我們通過改變單體丙烯酸，N-異丙基丙烯酰胺和交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的量來控制殼層結(jié)構(gòu)的厚度和致密度。動態(tài)直徑Dz的測試結(jié)果表明，當增加單體丙烯酸和N-異丙基丙烯酰胺的含量時，凝膠微球的殼層會變厚，從而使得其溶脹度會增大;然而當增加交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰

15、胺的量時，凝膠微球的網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的剛性增強，使得其對pH的響應變得溫和，但是當在同一pH緩沖液中，增加交聯(lián)劑含量時凝膠微球的動態(tài)直徑Dz卻比未增加交聯(lián)劑含量時要大。我們認為這是由于沸騰無皂乳液聚合的溫度要遠高于交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的LCST，所以可知N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺相對于丙烯酸而言較疏水，故我們推測交聯(lián)劑含量的增加使得丙烯酸均相聚合量大為減少，為了穩(wěn)定微球從而使得丙烯酸更多地參與到凝膠殼層的聚合中去了，從而導致凝膠微球

16、的殼層厚度增加，故使得其溶脹程度增加。
　　 當pH緩沖液中未另外加入鹽分的時候，上述凝膠微球體現(xiàn)出很好的pH響應性。為了證明，該凝膠微球是否在生理環(huán)境下仍然有著很好的pH響應性，于是我們往一系列的pH緩沖液中都加入154mM的NaCl，該濃度與生物體內(nèi)的鹽分濃度相似。通過測試動態(tài)直徑Dz可知，即便在生理鹽分濃度下，凝膠微球仍然體現(xiàn)出很好的pH響應性。與未加鹽分且在同一pH值所測得的動態(tài)直徑Dz相比，加入了154mM的凝膠微球動

17、態(tài)直徑Dz要小，是由于鹽分濃度的增加使得Donna滲透壓降低而導致凝膠微球殼層收縮。
　　 我們的目標是將上述凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在生理環(huán)境下成功應用于Japanese medaka的活體成像研究，且能夠保證光子晶體顆粒在生物體內(nèi)仍然能夠有著很明顯的顏色改變，以及能夠保持結(jié)構(gòu)的完整性。為此，我們將上述凝膠微球組裝成光子晶體顆粒后于pH緩沖液中發(fā)現(xiàn)，在種子共聚合過程中，當加入的單體含量較少時，由其所組裝成的光子晶體顆粒的p

18、H響應的顏色跨度小，僅從pH3時候的紫色到pH11時候的藍綠色，且從Japanese medaka的活體成像圖難以分辨出其體內(nèi)pH的改變。然而，當單體含量增加，交聯(lián)劑含量相對不變的情況下，由其所組裝成的光子晶體顆粒有著很好的pH響應，而且有著很大的顏色跨度從pH3時候的紫色到pH11時候的明亮綠色，但是由于交聯(lián)劑含量未改變，從而使得光子晶體顆粒結(jié)構(gòu)易受破壞而導致Bragg衍射很弱:組裝成光子晶體顆粒的凝膠微球的殼層結(jié)構(gòu)在低交聯(lián)度時很柔軟

19、，容易過分溶脹而導致堆積結(jié)構(gòu)易受到破壞，Japanese medaka的活體成像圖亦證明了這一點。當我們增加交聯(lián)劑的含量時，既能夠使得凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒有著很大的顏色跨度，同時亦能夠保持很好的結(jié)構(gòu)完整性。
　　 在我們將pH響應性的光子晶體顆粒喂給Japanese medaka吃前，我們先檢測了光子晶體顆粒在一系列未加有NaCl的pH緩沖液中，以及加有38.5mM，77mM和154mM的NaCl的pH緩沖液中的反射光譜

20、。通過比較發(fā)現(xiàn)，隨著鹽分濃度的增加，光子晶體顆粒的pH響應顏色改變跨度變窄，但是卻依然在pH3和pH9時顏色上有著明顯的區(qū)別，與此同時，光子晶體顆粒能夠在生理鹽分濃度下有著很好的pH響應性。故此，我們將光子晶體顆粒喂給出生五天的Japanese medaka吃。24h后顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，光子晶體顆粒在Japanese medaka體內(nèi)清晰可見，且未出現(xiàn)任何毒副作用。由于Japanese medaka在年幼時是透明的，且沒有胃，食道直接連接

21、到中腸段，故其主要的消化部位是在中腸段。由胰腺，腸壁，膽汁和肝臟分泌的消化酶主要用于食物中的蛋白，脂肪和糖類的分解。對大部分teleostei而言，其消化酶作用的最佳pH值是堿性大約為pH7-9。Japanesemedaka活體成像圖表明，Japanese medaka的腸呈現(xiàn)環(huán)狀，且于中腸段，光子晶體顆粒呈現(xiàn)出明亮的綠色，然而位于后腸段，光子晶體顆粒呈現(xiàn)出藍色。故我們可以推測，Japanese medaka的中腸段pH值大約為8-9，

22、而后腸段pH值大約為4-5，這與文獻報道相符。
　　 由此，我們利用pH響應性的光子晶體顆粒成功地實現(xiàn)了Japanese medaka活體成像研究，且了解到其體內(nèi)的形貌和微觀pH環(huán)境，這不僅為光子晶體顆粒的應用開辟了一個全新的領域，與此同時亦是對生物學、解剖學提供了一種全新的探究生物體微觀環(huán)境的方法。
　　 3、無毒光子晶體顆粒用于活體成像分析淡水和海水medaka的腸胃形貌和離子濃度狀況
　　 我們利用pH響應

23、性的光子晶體顆粒成功地實現(xiàn)了Japanese medaka活體成像研究，且了解到其體內(nèi)的形貌和微觀pH環(huán)境，與此同時，我們想更深入探索medaka體內(nèi)的鹽分濃度，以及淡水和海水medaka的區(qū)別。
　　 與前部分一樣，我們利用沸騰無皂乳液聚合制備了以聚苯乙烯/聚丙烯酸微球為核和以聚甲基丙烯酸羥乙酯/聚對苯乙烯磺酸鈉為殼層的凝膠微球。在種子共聚合過程中，通過改變交聯(lián)劑的含量來進行對比得到凝膠微球動態(tài)直徑Dz的差別。動態(tài)光散射所測得

24、的Dz表明，由于對苯乙烯磺酸鈉的含量較低，而且是很強的電解質(zhì)，在聚合過程中，單獨改變交聯(lián)劑N,N'-亞甲基雙丙烯酰胺的濃度對凝膠微球的表面性質(zhì)改變不大。故不同交聯(lián)劑濃度聚合所得到的凝膠微球的Dz在0-500mM的NaCl溶液中變化趨勢相似，而且是僅受離子濃度的影響而不會受pH影響。
　　 由上述兩種不同交聯(lián)劑濃度聚合所得到的凝膠微球組裝成的光子晶體顆粒在0-500mM的NaCl溶液中的顏色改變也基本上一樣，由0mM的NaCl時的

25、明亮的綠色轉(zhuǎn)變?yōu)?00mM的NaCl時的紫色，這是由于兩種凝膠微球的溶脹度接近從而使得Bragg衍射差異較小。從反射光譜圖可以看出，光子晶體顆粒的Bragg衍射隨著離子濃度增加而藍移，而且顏色轉(zhuǎn)變明顯，在NaCl的濃度為50mM時出現(xiàn)一個轉(zhuǎn)折點。
　　 眾所周知，淡水medaka生存在一個高滲透的環(huán)境中，因此體內(nèi)離子依靠擴散來排出體外，而水通過滲透進入體內(nèi)。為了維持體內(nèi)鹽分和水分的均衡，故淡水medaka通過腮來吸收離子，而體內(nèi)

26、過多的水分以尿液的形式排除體外。周圍的水會隨著食物一起進入淡水medaka的消化道內(nèi)，而腸就是medaka一個很重要的消化組織，因為離子的吸收也在這個部位進行。據(jù)文獻報道，淡水medaka中腸段的離子濃度要比后腸段的離子濃度要低，是由于該腸段的Na+-和K+-ATPases的濃度比后腸段的要高。這與我們用單獨離子響應的光子晶體顆粒驗證的結(jié)果相符，從淡水medaka的顯微鏡圖片我們可以看到，在medaka的中腸段，光子晶體顯示出明亮的綠色

27、，我們推測該段的離子濃度應該小于50mM，而后腸段中光子晶體顯示出藍色，故我們推測該段的離子濃度應該大于50mM。
　　 然而，海水medaka卻與淡水medaka生存環(huán)境恰恰相反，海水medaka周邊是一個低滲透的環(huán)境，水分是依靠腮表面擴散來排除體外，而大量的鹽分卻被攝入到體內(nèi)，所以很多海水魚的腎小球都很小甚至有的魚腎小球都退化了以減少水分的排除。海水medaka為了維持體內(nèi)水分的均衡，所以需要大口大口地喝水。大約60-85％

28、的海水在海水medaka的腸段吸收，同時伴隨著水分和離子的吸收。通過離子響應性的光子晶體活體成像圖我們可以看到，從海水medaka的中腸段到后腸段，光子晶體的顏色都一樣都是藍色，由此可知海水medaka體內(nèi)鹽分的濃度大于50mM，這與文獻報道的結(jié)果相符。
　　 結(jié)果表明，利用生物相容性和單獨離子響應性的光子晶體顆粒可以成功反映出淡水medaka和海水medaka體內(nèi)鹽分梯度，同時也揭示出兩種medaka體內(nèi)鹽分的差異是由于其生活