黃芩苷對(duì)ApoE---小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化的干預(yù)作用及潛在機(jī)制研究.pdf

1、第一部分黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的干預(yù)作用
　　目的：觀察黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠體內(nèi)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的干預(yù)作用。
　　方法：6周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠10只及6周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后分組干預(yù)。8周齡野生型 C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組，每日給予正常飼料和生理鹽水灌胃；8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組（即高脂組，10只）及干預(yù)組（即黃芩苷組，10

2、只）。模型組小鼠每日給予高脂飼料和生理鹽水灌胃，干預(yù)組小鼠每日給予高脂飼料和黃芩苷100mg/kg/d灌胃。實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為12周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水取食。實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束處死小鼠后分離心臟和胸腹主動(dòng)脈，行主動(dòng)脈竇部冰凍切片，采用油紅O染色法檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊。
　　結(jié)果：高脂飼料喂養(yǎng)12周后，油紅O染色可觀察到正常組小鼠主動(dòng)脈竇部血管壁無(wú)脂質(zhì)斑塊沉積，而模型組小鼠主動(dòng)脈竇部血管壁附著大面積脂質(zhì)斑塊。與模型組比較，黃芩苷干預(yù)組小鼠主

3、動(dòng)脈竇斑塊面積則明顯減少。
　　結(jié)論：黃芩苷干預(yù)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠能夠顯著抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。
　　第二部分黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平和肝臟膽固醇代謝關(guān)鍵因子的作用研究
　　目的：觀察黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠血脂水平和肝臟膽固醇代謝相關(guān)因子的作用。
　　方法：6周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠10只及6周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后分組干預(yù)。8周齡野生型 C57B

4、L/6J小鼠作為正常對(duì)照組，每日給予正常飼料和生理鹽水灌胃；8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組（即高脂組，10只）及干預(yù)組（即黃芩苷組，10只）。模型組小鼠每日給予高脂飼料和生理鹽水灌胃，干預(yù)組小鼠每日給予高脂飼料和黃芩苷100mg/kg/d灌胃。實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為12周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水取食。實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后禁食一晚，清晨經(jīng)眶靜脈取血分離血清，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清脂質(zhì)水平，包括總膽固醇（Total choles

5、terol, TC）、甘油三酯（Triglyceride, TG）、高密度脂蛋白膽固醇（High density lipoprotein cholesterol, HDL-C）；低密度脂蛋白膽固醇（Low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）水平則根據(jù)Friedewald公式算出。處死小鼠后分離肝臟，實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄 PCR(Real time reverse transcriptionPCR,

6、Real time RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶、低密度脂蛋白受體（LDLR）、前體蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9（PCSK9）、肝X受體（LXR）、ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1（ABCA1）和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G1（ABCG1）。
　　結(jié)果：與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清總膽固醇TC和低密度脂蛋白膽固醇LDL-C均顯著高于正常組小鼠，而高密度脂蛋白膽固醇HDL-C水平則顯著低于正常組小鼠；與模型組比較

7、，黃芩苷干預(yù)組小鼠血清總膽固醇 TC、低密度脂蛋白膽固醇LDL-C稍有降低但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其高密度脂蛋白膽固醇HDL-C水平無(wú)明顯變化。三組小鼠血清甘油三酯水平無(wú)明顯差異。高脂飼料喂養(yǎng)12周后，肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)因子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，黃芩苷干預(yù)組小鼠肝臟HMG-CoA還原酶、LDLR和PCSK9 mRNA水平無(wú)明顯變化，但LXR、ABCA1和ABCG1mRNA水平顯著增加。
　　結(jié)論：黃芩苷干預(yù)12周未降低高脂飼料喂養(yǎng)的A

8、poE-/-小鼠血清脂質(zhì)水平，但能夠顯著上調(diào)部分促膽固醇流出的相關(guān)因子(LXR、ABCA1和ABCG1)的表達(dá)，這可能對(duì)黃芩苷抑制動(dòng)脈粥樣硬化斑塊有一定促進(jìn)作用。
　　第三部分黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目和功能的作用研究
　　目的：觀察黃芩苷對(duì)ApoE-/-小鼠體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目和功能的影響。
　　方法：6周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠10只及6周齡雄性ApoE-/-小鼠20只，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后

9、分組干預(yù)。8周齡野生型 C57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組，每日給予正常飼料和生理鹽水灌胃；8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組（即高脂組，10只）及干預(yù)組（即黃芩苷組，10只）。模型組小鼠每日給予高脂飼料和生理鹽水灌胃，干預(yù)組小鼠每日給予高脂飼料和黃芩苷100mg/kg/d灌胃。實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為12周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水取食。實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束后禁食一晚，清晨經(jīng)眶靜脈取血分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked im

10、munosorbent assay,ELISA）檢測(cè)血清中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）相關(guān)細(xì)胞因子：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor beta,TGF-β）和白介素10（Interleukin10,IL-10）。處死小鼠后分離脾臟、心臟和胸腹主動(dòng)脈。新鮮脾臟分離出單個(gè)核細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整至106cells/mL，用FITC標(biāo)記的抗CD4抗體、APC標(biāo)記的抗CD25

11、抗體和PE/Cy5標(biāo)記的抗Foxp3抗體標(biāo)記Tregs，隨后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，流式軟件分析Tregs細(xì)胞比例。胸腹主動(dòng)脈則行Real time RT-PCR和免疫印跡(Western blot)檢測(cè)Foxp3 mRNA和蛋白表達(dá)水平。心臟主動(dòng)脈竇冰凍切片后利用抗Foxp3抗體行免疫組化染色。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠脾臟Tregs的數(shù)目比例、主動(dòng)脈Foxp3 mRNA和蛋白表達(dá)水平均增加；黃芩苷干預(yù)后ApoE-/

12、-小鼠脾臟 Tregs的比例、主動(dòng)脈 Foxp3mRNA和蛋白表達(dá)比模型組進(jìn)一步增加。免疫組化檢測(cè)斑塊內(nèi) Tregs，與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠斑塊內(nèi)Tregs增加，而黃芩苷干預(yù)后斑塊內(nèi)Tregs數(shù)目比模型組進(jìn)一步增加。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清TGF-β和IL-10水平與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而黃芩苷干預(yù)組小鼠血清TGF-β和IL-10水平顯著增加。
　　結(jié)論：黃芩苷干預(yù)ApoE-/-小鼠，能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)Fo

13、xp3表達(dá)，增加脾臟和斑塊內(nèi)的Tregs的數(shù)目，促進(jìn)Tregs分泌抗炎因子TGF-β和IL-10。這是黃芩苷抑制斑塊進(jìn)展的重要機(jī)制。
　　第四部分黃芩苷在翻譯后水平對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性標(biāo)志物Foxp3的作用研究
　　目的：觀察黃芩苷在翻譯后水平對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特異性標(biāo)志物Foxp3的影響。
　　方法：6周齡雄性野生型C57BL/6J小鼠25只及6周齡雄性ApoE-/-小鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后分組干預(yù)。8周齡野生型 C

14、57BL/6J小鼠作為正常對(duì)照組，每日給予正常飼料和生理鹽水灌胃；8周齡ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為兩組：模型組（即高脂組，25只）及干預(yù)組（即黃芩苷組，15只）。模型組小鼠每日給予高脂飼料和生理鹽水灌胃，干預(yù)組小鼠每日給予高脂飼料和黃芩苷100mg/kg/d灌胃。實(shí)驗(yàn)干預(yù)時(shí)間為12周，實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水取食。分別在8、12、16和20周齡末，采用Real time RT-PCR檢測(cè)正常對(duì)照組和模型組小鼠主動(dòng)脈組蛋白去乙酰化酶9（His

15、tone deacetylase9, HDAC9）和HDAC6 mRNA變化趨勢(shì)；且在實(shí)驗(yàn)?zāi)┢趯?duì)比三組小鼠主動(dòng)脈HDAC9和HDAC6的mRNA和蛋白水平。實(shí)驗(yàn)干預(yù)結(jié)束處死小鼠后分離脾臟、心臟和胸腹主動(dòng)脈。新鮮脾臟分離出單個(gè)核細(xì)胞，采用免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）和Western blot檢測(cè) Foxp3蛋白乙?；?。心臟主動(dòng)脈竇部冰凍切片后行免疫熒光（Immunofluorescence，IF）雙染，檢測(cè)

16、主動(dòng)脈Foxp3乙?；?。
　　結(jié)果：與正常對(duì)照組小鼠比較，模型組小鼠主動(dòng)脈HDAC9和HDAC6mRNA表達(dá)呈現(xiàn)持續(xù)上升狀態(tài)，且在實(shí)驗(yàn)中后期顯著高于正常對(duì)照組小鼠。黃芩苷干預(yù)后顯著降低HDAC9和HDAC6mRNA和蛋白表達(dá)。免疫沉淀和免疫熒光檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)模型組小鼠Foxp3乙?；斤@著低于正常對(duì)照組，而黃芩苷干預(yù)能夠顯著增加Foxp3乙酰化水平。
　　結(jié)論：黃芩苷干預(yù)高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，能夠部分通過(guò)下調(diào)HDA