根霉ZM-10脂肪酶酶學(xué)性質(zhì)和化學(xué)修飾.pdf

1、脂肪酶在釀酒工業(yè)中的應(yīng)用具有十分重要的意義，大曲中的根霉（Rhizopus）是白酒發(fā)酵過程中酒體香氣成分形成的主要微生物之一。濃香型白酒的風(fēng)格及酒質(zhì)的優(yōu)劣，主要取決于酒體中己酸乙酯含量的高低以及與其它酯類物質(zhì)的比例是否協(xié)調(diào)。根霉脂肪酶在釀酒生產(chǎn)中得以應(yīng)用，但其酶學(xué)特性和催化機(jī)理未研究闡明，存在酶活較低、生香效果不穩(wěn)定、增香針對性不強(qiáng)、應(yīng)用技術(shù)條件不明確、使用范圍不廣等實際問題，在釀酒工業(yè)也遠(yuǎn)未得到充分應(yīng)用。因此，深入研究和闡明根霉脂肪酶

2、的酶學(xué)性質(zhì)和作用機(jī)制對其在食品工業(yè)中的應(yīng)用具有較大的理論和實踐意義。本論文以明確根霉ZM-10脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)和活性中心的氨基酸種類為目標(biāo)，研究了根霉ZM-10脂肪酶分離純化條件、基本酶學(xué)性質(zhì)、表現(xiàn)酶活性所必需的氨基酸種類，主要結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 1.根霉ZM-10脂肪酶的分離純化：根霉ZM-10脂肪酶經(jīng)過硫酸銨鹽析、DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析、Sephardex G-100凝膠過濾層析得脂肪酶，純化倍

3、數(shù)15.3倍，酶活回收率22.2％。根霉ZM-10脂肪酶分離純化條件為：最佳硫酸銨鹽析飽和度70％；DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析最佳條件：上樣量5mL、流速3mL/min、每管收集3mL、洗脫體積10倍柱體積、洗脫最佳鹽濃度0.4mol/L；Sephardex G-100凝膠過濾層析最佳條件：上樣量3mL、流速：自然流速、每管收集1.8mL、洗脫體積：2倍柱體積。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳檢測得該脂肪酶的分子量約為4

4、4kDa。
　　 2.根霉ZM-10脂肪酶的基本酶學(xué)性質(zhì)：對純化后根霉ZM-10脂肪酶基本酶學(xué)性質(zhì)研究表明：該脂肪酶的最適反應(yīng)溫度35℃，最適pH為8.0。該酶在20℃下1h時仍保持90％以上的活力，在pH7.5、8.0具有較高的穩(wěn)定性。Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+及EDTA對其活性影響較小，Zn2+具有顯著的抑制作用。醇類有機(jī)溶劑對該脂肪酶的活性有一定的抑制作用，其在極性較小的烷烴類有機(jī)溶劑中穩(wěn)定性良好。

5、　　 3.根霉ZM-10脂肪酶活性中心的化學(xué)修飾：采用NBS、EDC、DEPC、CH-T、PMSF、DTNB等6種化學(xué)修飾劑對根霉ZM-10脂肪酶進(jìn)行化學(xué)修飾、底物保護(hù)實驗，研究了其分子中氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)與酶活性中心的關(guān)系。實驗結(jié)果表明：酸性氨基酸（天冬氨酸/谷氨酸）殘基、組氨酸殘基、絲氨酸殘基、色氨酸殘基為根霉ZM-10脂肪酶活性的必需基團(tuán)。酸性氨基酸（天冬氨酸/谷氨酸）殘基、組氨酸殘基和絲氨酸殘基位于根霉ZM-10脂肪酶的活性中心部