耐鹽野生大豆DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與分析.pdf

1、低溫、干旱、鹽堿等逆境條件嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)亟待解決的重大問題。通過基因工程手段改良植物的抗逆性是提高作物產(chǎn)量的有效途徑之一。而如何利用抗逆基因資源，從大量的滲透脅迫響應(yīng)基因中尋找到能夠綜合性提高作物抗逆性的基因，是植物滲透脅迫基因工程的重要前提。轉(zhuǎn)錄因子在植物逆境信號(hào)傳遞過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可以同時(shí)調(diào)控多個(gè)下游基因的表達(dá)，從而提高植物的抗逆性。 耐鹽野生大豆具有豐富的抗逆基因資源，是基因克隆

2、的理想材料。本研究以耐鹽野生大豆為試材，通過電子克隆、同源克隆、酵母單雜交方法克隆DREB(Dehydration。ResponsiveElement-Bindingprotein)類轉(zhuǎn)錄因子基因；利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)基因的結(jié)構(gòu)、并對(duì)獲得的全長(zhǎng)DREB轉(zhuǎn)錄因子基因做進(jìn)化分析；應(yīng)用同酵母單雜交系統(tǒng)對(duì)獲得的DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因進(jìn)行體內(nèi)結(jié)合特異性分析，同時(shí)比較其與DRE順式作用元件結(jié)合能力的強(qiáng)弱。為野生大豆中DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的功能研

3、究及其在植物抗?jié)B透脅迫基因工程中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容如下： 1.電子克隆方法克隆GsDREB1基因應(yīng)用電子克隆技術(shù)在耐鹽野生大豆中克隆了1個(gè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因，與GmDREB1基因序列相似性達(dá)到99.71％，命名為GsDREB1。經(jīng)SMART和InterProScan預(yù)測(cè)表明，GsDREB1基因含有AP2結(jié)構(gòu)域。 2.同源克隆方法克隆DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因應(yīng)用同源克隆方法在耐鹽野生大豆中克隆了5個(gè)DREB類轉(zhuǎn)

4、錄因子基因，分別命名為GsDREBa、GsDREBb，GsDREBc，GsDREB2、GsDREB3。分別將各條基因進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果為：GsDREBc與GmDREBc的相似性為99.33％；GsDREBb與GmDREBb的相似性為97.44％；GsDREBa與GmDREBa與的相似性為93.08％；GsDREB2與GmDREB2的相似性為95.60％：GsDREB3與GmDREB3的相似性為100.00％。SMART和InterP

5、roScan預(yù)測(cè)結(jié)果表明這5個(gè)基因都含有AP2結(jié)構(gòu)域。 3.酵母單雜交方法克隆與DRE順式作用元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子基因?qū)⒛望}野生大豆幼苗進(jìn)行脅迫處理，構(gòu)建cDNA融合文庫(kù)。以DRE元件為“誘餌”，應(yīng)用酵母單雜交方法克隆DREB類轉(zhuǎn)錄因子。從A52號(hào)克隆中得到了一條232bp的片段，這個(gè)片段不含有起始密碼子和終止密碼子，經(jīng)SMART預(yù)測(cè)此片段含有AP2結(jié)構(gòu)域。5’RACE延伸出了198bp，但這198bp在三種讀碼方式下都含有終止密

6、碼子。 4.DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因體內(nèi)結(jié)合特異性分析經(jīng)SMART預(yù)測(cè)，獲得6個(gè)DREB基因的AP2結(jié)構(gòu)域序列。應(yīng)用Clastalx1.83軟件將6個(gè)基因的結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明6個(gè)基因結(jié)構(gòu)域序列都具有典型的AP2結(jié)構(gòu)域特征。PCR擴(kuò)增6個(gè)基因保守結(jié)構(gòu)域，并在保守結(jié)構(gòu)域和A52克隆兩端引入同源重組位點(diǎn)。應(yīng)用酵母單雜交系統(tǒng)分析6個(gè)基因結(jié)構(gòu)域的體內(nèi)結(jié)合特異性，同時(shí)將轉(zhuǎn)化混合物涂布在含有不同濃度3-AT的三缺SD培養(yǎng)基上，比較它們與D

7、RE順式作用元件結(jié)合能力的強(qiáng)弱。結(jié)果表明GsDREBa，GsDREBb，GsDREBc、GsDREB1，GsDREB2、GsDREB3都能夠與DRE元件發(fā)生特異性結(jié)合，且與DRE順式作用元件結(jié)合能力相當(dāng)。但A52克隆的結(jié)合力較其它6個(gè)基因弱很多。 5.DREB類轉(zhuǎn)錄因子基因的進(jìn)化分析應(yīng)用DNAstar軟件對(duì)GsDREBa、GsDREBb、GsDREBc、GsDREB1、GsDREB2、GsDREB36個(gè)基因進(jìn)行進(jìn)化分析。進(jìn)化樹直