黑曲霉產(chǎn)單寧酶與固定化酶制備沒食子酸及其丙酯的研究.pdf

1、單寧酶是一種?；饷?，是在單寧酸等誘導(dǎo)劑存在下合成的誘導(dǎo)酶，已廣泛應(yīng)用于食品飲料、化妝品和飼料工業(yè)等方面。但由于目前酶法的生產(chǎn)水平較低，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。同時(shí)，沒食子酸及其沒食子酸酯類化合物是重要的醫(yī)藥和化工原料，市場(chǎng)上的這類產(chǎn)品基本是由五倍子單寧及塔拉單寧酸水解生產(chǎn)而來的，因?yàn)樗釅A法水解會(huì)造成的環(huán)境污染、設(shè)備腐蝕等問題。多年來，人們一直在尋求用單寧酶法來生產(chǎn)沒食子酸及其沒食子酸酯類化合物方法來替代原有工藝。因此，開展相關(guān)研

2、究以提高單寧酶生產(chǎn)水平及酶法轉(zhuǎn)化沒食子酸及其沒食子酸酯類化合物具有積極的現(xiàn)實(shí)意義。
　　 本文采用實(shí)驗(yàn)室保藏的黑曲霉菌株為產(chǎn)單寧酶的出發(fā)菌株，采用紫外和氮離子注入方式對(duì)其進(jìn)行誘變選育，并對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)單寧酶條件、黑曲霉發(fā)酵動(dòng)力學(xué)、單寧酶的固定化及酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，對(duì)固定化單寧酶轉(zhuǎn)化沒食子酸和沒食子酸丙酯條件進(jìn)行優(yōu)化。主要研究結(jié)果如下：
　　 產(chǎn)單寧酶菌株選育以黑曲霉產(chǎn)單寧酶菌株為試驗(yàn)菌株，經(jīng)篩選培養(yǎng)得到酶活為86 U/m

3、L的菌株N5。以N5為出發(fā)菌株經(jīng)過紫外誘變，得到酶活為158 U/mL的菌株N5-U5-3。用N+離子對(duì)N5-U5-3進(jìn)行誘變選育，經(jīng)過篩選后得到編號(hào)為03號(hào)的菌株，酶活力為198U/mL。該菌株具有較好的遺傳穩(wěn)定性，是一株比較理想的單寧酶高產(chǎn)菌株，命名為黑曲霉111(Aspergillus niger111)。
　　 產(chǎn)單寧酶條件優(yōu)化通過單因素試驗(yàn)、中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法對(duì)黑曲霉的產(chǎn)單寧酶條件進(jìn)行優(yōu)化。確定對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶影響最

4、大的因素依次為單寧濃度、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間，以及其最適產(chǎn)酶條件為：30℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，單寧濃度1.76％，初始pH6.0，接種量10％.，裝液量20％，培養(yǎng)時(shí)間82.2h。在此條件下，發(fā)酵單寧酶活力可達(dá)380.34 U/mL。
　　 黑曲霉發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究以Aspergillus niger111為實(shí)驗(yàn)菌種，對(duì)其進(jìn)行分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究。以該菌株在5 L發(fā)酵罐中分批發(fā)酵的數(shù)據(jù)為依據(jù)，建立分批發(fā)酵生產(chǎn)單寧酶的菌體生長、單寧

5、酶合成以及基質(zhì)消耗動(dòng)力學(xué)模型。
　　 單寧酶固定化篩選LX-1000HA樹脂作為載體，對(duì)游離單寧酶進(jìn)行固定化，通過中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和RSM，對(duì)LX-1000HA樹脂固定化單寧酶的條件進(jìn)行優(yōu)化，得出最佳工藝條件為酶液/載體比17.6(v/m)、pH6.9、時(shí)間24 h、溫度36.5℃，該條件下固定化酶活力達(dá)到(18495±200)u/g，對(duì)溫度和pH的適應(yīng)性更廣，酶活回收率為45.25％。
　　 固定化酶制備沒食子酸及其丙