藥物與糖蛋白、細(xì)胞膜、細(xì)菌相互作用的毛細(xì)管電泳方法研究.pdf

1、生物大分子、靶體、細(xì)胞與藥物相互作用研究是現(xiàn)代高通量藥物篩選的重要基礎(chǔ)，毛細(xì)管電泳是研究分子間相互作用的重要技術(shù)手段之一。為了更好地了解生物分子與小分子間的相互作用，本論文以細(xì)胞內(nèi)的生物成分（糖蛋白）、細(xì)胞部分組織（細(xì)胞膜）以及完整的細(xì)胞（細(xì)菌）為研究對(duì)象，采用不同模式的毛細(xì)管電泳方法，對(duì)生物分子與藥物間的特異性相互作用及非特異性相互作用進(jìn)行了系統(tǒng)性研究。研究?jī)?nèi)容主要包括三部分：
　　第一部分：以生物大分子糖蛋白為受體，基于硼酸基

2、團(tuán)與順式二羥基化合物的特異性絡(luò)合作用，研究了糖蛋白與硼酸間的特異性相互作用機(jī)理及其應(yīng)用。
　　首先，采用毛細(xì)管電泳等電聚焦-整體柱成像檢測(cè)(CIEF-WCID)實(shí)時(shí)在線研究了硼酸與糖蛋白的特異性相互作用機(jī)理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，加上電壓后，載體兩性電解質(zhì)在毛細(xì)管分離柱上形成不同的pH梯度，從而為硼酸與糖蛋白的相互作用創(chuàng)造不同的pH環(huán)境。當(dāng)硼酸濃度增大到0.05 mol/L時(shí)，在電泳譜圖中可以直觀地看到硼酸與去唾液酸胎球蛋白產(chǎn)生的復(fù)合物的峰。

3、同時(shí)，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)硼酸與去唾液酸胎球蛋白相互作用過程，發(fā)現(xiàn)硼酸與去唾液酸胎球蛋白復(fù)合物的峰一直往高pH位置遷移，在監(jiān)測(cè)的50 min里，復(fù)合物峰從pH=5.88的位置逐漸遷移到pH=8.22的位置，這一規(guī)律正好符合了硼酸與糖蛋白親和作用的工作機(jī)理。WCID具有信息量大、實(shí)時(shí)獲得各組分的動(dòng)態(tài)信息、分析時(shí)間短及高通量等優(yōu)點(diǎn)，可獲取更多相互作用的重要信息，是相互作用研究的一個(gè)重要手段。
　　接著，利用硼酸與糖蛋白的特異性相互作用機(jī)制，選

4、擇兩種不同孔徑大小的氨基苯硼酸為涂層萃取材料，建立了一種選擇性萃取糖蛋白的固相微萃取方法，并采用CIEF-WCID對(duì)萃取后的樣品進(jìn)行了快速分析檢測(cè)。在最優(yōu)化條件下，從標(biāo)準(zhǔn)緩沖液、磷酸鹽體系、血漿和血液等不同基質(zhì)中萃取及富集糖蛋白。
　　第二部分：以紅細(xì)胞膜為研究對(duì)象，采用峰漂移法及動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳兩種模式研究了藥物與細(xì)胞膜相互作用的過程，建立了基于毛細(xì)管電泳測(cè)定藥物與細(xì)胞膜相互作用參數(shù)的方法。
　　首先，以細(xì)胞膜在毛細(xì)管內(nèi)構(gòu)

5、成假固定相，采用親和毛細(xì)管電泳研究細(xì)胞膜與藥物的相互作用。以西酞普蘭和兔紅細(xì)胞膜為相互作用模型，以不同濃度的細(xì)胞膜混懸液為電泳緩沖液，采用峰漂移法，并結(jié)合Scatchard分析，測(cè)得西酞普蘭、依匹斯汀與兔紅細(xì)胞膜的結(jié)合常數(shù)。該方法簡(jiǎn)單、快速，為研究藥物與細(xì)胞膜的相互作用提供了新的技術(shù)手段，為高通量篩選藥物膜通透性和活性，以及評(píng)價(jià)藥物在體內(nèi)吸收提供一種新的方法。
　　在研究細(xì)胞膜與藥物相互作用的過程中，發(fā)現(xiàn)藥物在跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過程中存在動(dòng)

6、力學(xué)過程。于是，在區(qū)段-區(qū)段動(dòng)力學(xué)毛細(xì)管電泳（ppKCE）的理論基礎(chǔ)上，以兔紅細(xì)胞膜、人紅細(xì)胞膜為受體，首次同時(shí)測(cè)得了表征西酞普蘭、加替沙星、羅沙替丁、西替利嗪與細(xì)胞膜間結(jié)合快慢的正向結(jié)合速率常數(shù)kon、反向解離速率常數(shù)kof、以及配體與受體間相互作用的結(jié)合常數(shù)Kb。實(shí)驗(yàn)中考察了遷移時(shí)間及峰高的穩(wěn)定性，pH值對(duì)藥物與細(xì)胞膜相互作用動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。該方法為評(píng)價(jià)藥物療效、毒性及藥物動(dòng)力學(xué)研究提供一種新的方法。
　　第三部分，以完整細(xì)

7、胞——細(xì)菌作為生物大分子受體，采用毛細(xì)管電泳研究了細(xì)菌與抗菌藥物間的特異性相互作用。
　　先采用ppKCE方法測(cè)定藥物與細(xì)菌相互作用的解離速率常數(shù)。首先優(yōu)化電泳條件，對(duì)樣品檢測(cè)波長(zhǎng)、藥物與大腸桿菌的荷電性、緩沖液濃度、pH值進(jìn)行了選擇；在最優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，利用出峰時(shí)間及峰高求得大腸桿菌與6種抗菌藥間的解離速率常數(shù)。結(jié)果表明不同作用機(jī)制的抗生素與大腸桿菌相互作用的解離速率常數(shù)各不相同，同種作用機(jī)制的抗生素與大腸桿菌相互作用的解離速率

8、常數(shù)強(qiáng)度相近。該方法對(duì)藥物在體內(nèi)藥物代謝動(dòng)力學(xué)，藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)以及藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的評(píng)價(jià)具有一定的指導(dǎo)意義。
　　然后，基于喹諾酮類藥物與細(xì)菌間特異性抗菌機(jī)制，首次采用區(qū)段灌注毛細(xì)管電泳技術(shù)，以大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌為手性選擇劑對(duì)氧氟沙星對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行拆分。首先優(yōu)化了緩沖液離子強(qiáng)度、pH值、分離電壓以及細(xì)菌灌注時(shí)間等分離條件，結(jié)果表明，3種細(xì)菌對(duì)氧氟沙星對(duì)映體均有立體選擇性，且在7 min內(nèi)成功實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌、銅綠假

9、單胞菌對(duì)氧氟沙星的基線分離，結(jié)果也說明了氧氟沙星對(duì)革蘭氏陰性菌的抗菌作用效果要強(qiáng)一些。同時(shí)采用左氧氟沙星、撲爾敏、西替利嗪、細(xì)胞膜對(duì)分離結(jié)果進(jìn)行了陰性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。建立了一種依據(jù)細(xì)菌與手性抗菌藥間的高度立體選擇性，以細(xì)菌為手性拆分劑對(duì)抗生素對(duì)映體進(jìn)行拆分的新方法，該方法具有生物樣品用量少、拆分時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，為抗生素的手性拆分開拓了一種新的方法。
　　論文以糖蛋白、細(xì)胞膜和細(xì)菌為研究對(duì)象，由生物大分子到完整細(xì)胞，從對(duì)糖蛋白與小分子間的相