基于聚合物-藥物多重相互作用的高效納米傳輸系統(tǒng)研究.pdf

1、許多重要的治療藥物由于極小的水溶性限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用，因此開(kāi)發(fā)有效的傳遞系統(tǒng)是一項(xiàng)十分重要的工作。作為理想的藥物傳遞系統(tǒng)，它必須能夠?qū)⑺幬镛D(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)特定部位，并在該部位釋放其中的藥物。同時(shí)，載體本身應(yīng)無(wú)毒或能夠降解為無(wú)毒產(chǎn)物并從體內(nèi)消除。兩親性共聚物通過(guò)自組裝形成的聚合物組裝體作為新一代藥物傳輸系統(tǒng)近年來(lái)備受研究人員的青睞,廣泛用于小分子藥物、多肽、蛋白以及基因等治療藥物的傳輸。
　　 近年來(lái)合成化學(xué)的發(fā)展大大推動(dòng)了智能

2、型聚合物膠束的設(shè)計(jì)、制備，這些系統(tǒng)能夠靶向特異的病灶部位并在外部刺激作用下釋放藥物。到目前為止，已有6個(gè)以上聚合物納米組裝體系統(tǒng)作為抗癌藥物的納米給藥系統(tǒng)正在進(jìn)行臨床研究，其中涉及的抗癌藥物有阿霉素、紫杉醇及喜樹(shù)堿等藥物。不過(guò)，聚合物組裝體作為疏水藥物的傳輸系統(tǒng)，具有載藥量較低的缺點(diǎn)，直接影響其后期治療效果、甚至正常療效的發(fā)揮。一般而言，難溶性藥物通過(guò)疏水作用包封于聚合物組裝體的疏水微區(qū)，這種藥物/聚合物分子間單一的非共價(jià)鍵力是導(dǎo)致藥物

3、負(fù)載量較低的主要原因。為了解決該類藥物傳輸系統(tǒng)所面臨的這一問(wèn)題，本課題提出通過(guò)聚合物和藥物間的多重非共價(jià)鍵作用可以提高聚合物納米組裝體的藥物負(fù)載性能這一假設(shè)。為了驗(yàn)證該假設(shè)，本研究設(shè)計(jì)、合成了β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺(PEI-CD)，并選用吲哚美辛(IND)作為模型藥物。由于PEI-CD 同時(shí)含有伯胺、仲胺、叔胺及β-環(huán)糊精單元，該材料與吲哚美辛之間同時(shí)存在靜電、氫鍵及主客體相互作用。此外，藥物分子本身的疏水基團(tuán)介導(dǎo)的疏水作用也有利于高

4、效藥物負(fù)載系統(tǒng)的構(gòu)建。
　　 通過(guò)對(duì)甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精(6-Monotosyl β-cyclodextrin)與聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)之間的親核取代反應(yīng)來(lái)合成PEI-CD。聚合物PEI-CD的結(jié)構(gòu)通過(guò)紅外光譜(FT-IR)和核磁共振光譜(1H-NMR)來(lái)確定。聚合物組成，即聚合物中β-CD取代量，通過(guò)1H-NMR 測(cè)定來(lái)計(jì)算得到。
　　 在此基礎(chǔ)上，通過(guò)PEI-CD和IND 之間

5、的多重非共價(jià)鍵相互作用構(gòu)建了殼-核型納米組裝體，作為高效藥物傳輸系統(tǒng)，其中多重非共價(jià)鍵作用主要包括靜電作用、氫鍵、主客體相互作用以及疏水作用。采用改良的透析法來(lái)制備IND/PEI-CD 納米組裝體。
　　 掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)對(duì)不同投藥比制備的組裝體的形態(tài)進(jìn)行觀察。藥物與聚合物之間的非共價(jià)鍵相互作用通過(guò)紅外光譜(FT-IR)、核磁共振光譜(NMR)進(jìn)行表征。
　　 藥物分子在組裝體中的存在形式通過(guò)差示掃

6、描量熱法(DSC)、X-射線衍射法(XRD)測(cè)定和激光共聚焦顯微鏡(CLSM)進(jìn)行觀察。紫外分光光度法測(cè)定吲哚美辛載藥量和包封率，表明其載藥量最高可達(dá)到71％。此外，PEI-CD與含有羧基的其他疏水性藥物，如布洛芬、二氟尼柳、氟比洛芬和萘普生等也能自發(fā)形成納米組裝體系統(tǒng)，載藥量可達(dá)到50％以上。選用環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物和聚乙二醇-聚（L-乳酸）共聚物進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明，環(huán)氧乙烷/環(huán)氧丙烷共聚物膠束系統(tǒng)的載藥量最高僅為22.9％，而聚

7、乙二醇-聚（L-乳酸）共聚物膠束系統(tǒng)的載藥量最高為18.9％。體外釋放動(dòng)力學(xué)研究顯示，IND/PEI-CD 自組裝體在pH 7.4的釋放介質(zhì)中24 h內(nèi)可釋放90％；模擬胃腸道環(huán)境中，在胃液（pH 1.2）中IND 釋放量極少,而轉(zhuǎn)移至模擬腸液(pH 7.4)中后，藥物在24 h內(nèi)仍能釋放90％以上，與此相比，相同條件下原料藥僅能釋放22％。大鼠灌胃給藥后，IND/PEI-CD 納米組裝體系統(tǒng)能維持藥物較高的濃度長(zhǎng)達(dá)4天，且其血藥濃度-

8、時(shí)間曲線下面積(AUC)是原料藥組的9倍。
　　 方法
　　 1.Β-環(huán)糊精鍵合聚乙烯亞胺的合成通過(guò)對(duì)甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精(6-Monotosyl β-cyclodextrin)與聚乙烯亞胺（PEI）之間的親核取代反應(yīng)來(lái)合成β-環(huán)糊精鍵合PEI，即PEI-CD。
　　 2.聚合物結(jié)構(gòu)表征和組成測(cè)定聚合物的結(jié)構(gòu)通過(guò)核磁共振光譜(1H-NMR)來(lái)確定。聚合物組成，即聚合物中β-CD取代量，通過(guò)1H-NMR 測(cè)定

9、來(lái)計(jì)算得到。
　　 3.藥物/PEI-CD組裝體微粒的制備采用改良的透析法制備載藥組裝體納米微粒。具體而言，將溶于水溶性有機(jī)溶劑中的藥物溶液在超聲作用下加入PEI-CD(10mg/ml)水溶液中，得到的混合體系在水溶液中透析即可得到載藥組裝體水溶液。其中涉及的藥物包括吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬。
　　 4.載藥組裝體中藥物含量的測(cè)定精密稱取一定量的載藥組裝體，將其分散于3 ml 乙醇溶液中，渦旋1min

10、后于8000rpm 離心10min，之后取出上清，如此重復(fù)3次后將上清液合并至10ml 容量瓶中定溶，一定波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度。吲哚美辛、萘普生、二氟尼柳、布洛芬和氟比洛芬測(cè)定波長(zhǎng)分別為310nm、271nm、306 nm、273 nm、287 nm。按以下公式分別計(jì)算載藥量與包封率。
　　 載藥量(％)=×100％組裝體中所含藥物量(mg)組裝體總量(mg)包封率(％)=×100％ 載藥量(％)理論載藥量(％)5. 藥物-聚合物

11、間多重相互作用的表征將藥物、聚合物、藥物聚合物物理混合物、載藥組裝體分別進(jìn)行紅外光譜(FT-IR)和核磁共振光譜(NMR)測(cè)定，以分析其多重相互作用力的存在。
　　 6. 載藥組裝體形態(tài)學(xué)及表面電位測(cè)定采用透射電子顯微鏡(TEM)、掃描電子顯微鏡(SEM)及原子力顯微鏡(AFM)來(lái)觀察微粒形貌。動(dòng)態(tài)光散射法(DLS)測(cè)定載藥組裝體的粒徑大小。表面電位分析儀測(cè)定載藥組裝體表面所帶電荷情況。
　　 7. 載藥組裝體中藥物存在

12、形式的表征通過(guò)差示掃描量熱儀(DSC)和X-射線衍射儀(XRD)測(cè)定以及激光共聚焦顯微鏡(CLSM)觀察，分析載藥組裝體中藥物的存在形式和分布行為。
　　 8. 載藥組裝體的表面修飾通過(guò)在組裝體中引入金剛烷基末端改性的聚乙二醇(PEG-Ada)實(shí)現(xiàn)其表面的PEG化，提高膠體穩(wěn)定性和再分散性。將溶于DMSO中的IND溶液在超聲作用下加入含有PEI-CD和PEG-Ada的水溶液中，得到的混合液在水溶液中透析即可得到表面PEG修飾的載

13、藥組裝體。
　　 9. 體外藥動(dòng)學(xué)研究取0.5 ml 載藥組裝體水溶液進(jìn)行體外釋放實(shí)驗(yàn)，同時(shí)稱取一定量的吲哚美辛原料藥、片劑作為對(duì)照。釋放分別在兩種不同的介質(zhì)中進(jìn)行：1)pH 7.4的PBS 緩沖液；2)模擬口服后胃腸道環(huán)境在pH 1.2和pH 7.4中進(jìn)行。計(jì)算累計(jì)釋放百分率，并繪制藥物累積釋放曲線。
　　 10. 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究大鼠灌胃給藥后，預(yù)定時(shí)間點(diǎn)采集血樣，3000rpm 離心10min 取血漿。血漿處理方法為

14、，50μl 血漿中加入100μl 乙腈和400μl 甲滅酸內(nèi)標(biāo)液（乙腈為溶劑）后渦旋1min，8000rpm 離心10min后取上清，氮?dú)庀麓蹈珊蠹尤?00μl 流動(dòng)相渦旋1min后進(jìn)樣，通過(guò)HPLC 測(cè)定藥物濃度。流動(dòng)相為乙腈-6 μM H3PO4水溶液(55:45，v:v)，流速1ml/min，柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm，進(jìn)樣量20μl，色譜柱采用C18 反相柱。
　　 使用DAS 軟件處理藥物濃度數(shù)據(jù)。
　　

15、 11. 載藥組裝體在腸道內(nèi)滯留時(shí)間及其對(duì)胃腸道刺激研究使用熒光標(biāo)記聚合物FITC-PEI-CD 制備IND 載藥組裝體，大鼠灌胃給藥后，預(yù)定時(shí)間點(diǎn)將其處死取胃腸道組織。HE 染色后顯微鏡下觀察胃腸道刺激情況，熒光顯微鏡下觀察載藥組裝體在腸道內(nèi)的滯留情況。
　　 結(jié)論
　　 1.通過(guò)對(duì)甲苯磺酰氯單取代β-環(huán)糊精與聚乙烯亞胺之間的親核取代反應(yīng)成功合成了具有伯胺、仲胺、叔胺和β-環(huán)糊精單元的親水性聚合物PEI-CD。2. 含

16、有羧基的疏水性藥物與PEI-CD 間的多重非共價(jià)鍵作用可以介導(dǎo)核-殼型載藥組裝體的形成；與傳統(tǒng)的僅通過(guò)疏水作用形成的載藥膠束相比，本研究制備的納米組裝體系統(tǒng)具有更高的藥物負(fù)載能力。從而證實(shí)了本課題提出的假設(shè)，即通過(guò)載體材料和藥物分子之間的多重非共價(jià)鍵作用可以制備高載藥組裝體納米系統(tǒng)。
　　 3.IND/PEI-CD 自組裝納米微粒經(jīng)表面PEG 修飾后可使組裝體在水溶液中的膠體穩(wěn)定性和再分散性大大提高。同時(shí)，這一組裝體可以作為其他