紫外光（UV-B）對金絲桃細(xì)胞中黃酮類次生產(chǎn)物合成的影響及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理研究.pdf

1、高等植物是植物藥等天然活性物質(zhì)的重要來源。雖然植物是一種可再生資源,但是由于受到栽培困難、生長速度慢、無計(jì)劃采伐以及近年來對天然活性物質(zhì)要求不斷增加等因素的影響使某些植物天然產(chǎn)物的供需矛盾日益突出。利用細(xì)胞全能性原理發(fā)展起來的植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)為植物天然活性物質(zhì)的生產(chǎn)提供了一條全新途徑。但目前制約該項(xiàng)技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的核心問題之一是普遍存在的培養(yǎng)細(xì)胞中活性物質(zhì)的低產(chǎn)現(xiàn)象,因此提高培養(yǎng)細(xì)胞代謝產(chǎn)物含量已經(jīng)成為決定細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)能否實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)

2、鍵因素。 中波紫外輻射(UV-B,280～320nm)對植物的影響是近年來的研究熱點(diǎn),低濃度的紫外線能誘導(dǎo)植物的多種反應(yīng),其中類黃酮物質(zhì)的快速積累是許多植物對UV-B處理的常見早期反應(yīng)之一。因此,利用UV-B處理植物細(xì)胞可以誘發(fā)黃酮次生物質(zhì)的合成積累,并成為提高植物培養(yǎng)細(xì)胞次生物質(zhì)產(chǎn)量的有效手段之一。然而,目前對UV-B誘發(fā)植物細(xì)胞黃酮類次生物質(zhì)合成積累的詳細(xì)機(jī)制尚不十分了解。 本文以本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存的金絲桃細(xì)胞為材料,

3、測定了UV-B對金絲桃中黃酮類物質(zhì)合成的影響,在確定UV-B對金絲桃細(xì)胞中類黃酮合成積累具有促進(jìn)作用的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究探討了UV-B誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)理,主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、金絲桃懸浮細(xì)胞系的建立和優(yōu)化。將固體培養(yǎng)的金絲桃愈傷組織接種到MS培養(yǎng)液中,為獲得最優(yōu)細(xì)胞生物量和黃酮含量,對培養(yǎng)液成分(植物激素組成、pH值和蔗糖濃度)、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和接種量等條件進(jìn)行優(yōu)化,得到了金絲桃懸浮細(xì)胞系的最適培

4、養(yǎng)條件：培養(yǎng)液為MS+1.5×10-5mol·L-1 NAA+10-6mol·L-1 BA+3％蔗糖,使用前pH值調(diào)至5.8,培養(yǎng)溫度為25℃,搖床轉(zhuǎn)速為100rpm,接種量為3g/50mL medium。并且在此培養(yǎng)條件下測得細(xì)胞生長周期為2周。在優(yōu)化培養(yǎng)條件的過程中,對傳代種細(xì)胞進(jìn)行篩選,最終獲得了生長速度較快、形態(tài)比較穩(wěn)定的金絲桃懸浮細(xì)胞系。 2、紫外光(UV-B)對金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的影響。將培養(yǎng)了5d的生長

5、旺盛的金絲桃細(xì)胞用UV-B處理后測定金絲桃細(xì)胞的生長量和黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果顯示處理后5h到30h內(nèi),雖然金絲桃細(xì)胞的生長量沒有顯著變化,但黃酮的產(chǎn)量大幅提高,表明UV-B處理可以誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累。 3、NO參與UV-B對金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累。數(shù)據(jù)表明UV-B處理后金絲桃細(xì)胞中一氧化氮(NO)的含量大幅增加；通過加入NO的專一性淬滅劑cPTIO和一氧化氮合酶抑制劑PBITU,發(fā)現(xiàn)它們不僅能抑制UV-

6、B誘導(dǎo)的NO的產(chǎn)生還能抑制UV-B觸發(fā)的黃酮類物質(zhì)的積累,表明UV-B處理可以激活金絲桃細(xì)胞中NO信號事件,而且還依賴NO信號分子誘發(fā)金絲桃中黃酮類物質(zhì)的合成積累。 4、H2O2是UV-B誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累必需的信號分子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示UV-B處理后金絲桃細(xì)胞中過氧化氫(H2O2)的含量大幅增加；通過加入過氧化氫酶CAT和質(zhì)膜NAD(P)H氧化酶抑制劑DPI,發(fā)現(xiàn)這兩者不僅能抑制UV-B誘導(dǎo)的H2O2的產(chǎn)生還能抑制

7、UV-B觸發(fā)的黃酮類物質(zhì)的積累,表明UV-B處理還可以激活金絲桃細(xì)胞中H2O2信號事件,而且H2O2信號分子也是參與UV-B誘發(fā)金絲桃中黃酮類物質(zhì)合成積累所必需的信號分子之一。 5、H2O2對NO誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累中的增效作用。以外源H2O2和NO分別處理金絲桃細(xì)胞,并測定細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)的含量,結(jié)果表明NO單獨(dú)處理能夠增加黃酮類物質(zhì)的合成而H2O2對其產(chǎn)量沒有影響：但同時(shí)加入H2O2和NO時(shí)比只用NO處理的金絲

8、桃細(xì)胞中黃酮產(chǎn)量高,說明H2O2本身對黃酮合成沒有影響,但能夠加強(qiáng)NO對金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成的積累,表明H2O2對NO誘發(fā)金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累中有增效作用。 6、H2O2和NO的信號互作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,H2O2處理可以提高細(xì)胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性并誘發(fā)細(xì)胞中NO合成,說明H2O2可以催化細(xì)胞中NO合成積累；而NO處理也可以提高細(xì)胞中H2O2水平,說明NO對細(xì)胞中H2O2的合成積累也具有促進(jìn)作用。試驗(yàn)結(jié)果

9、表明H2O2和NO信號分子之間存在著一種特殊的互催化信號放大作用,揭示了金絲桃細(xì)胞中NO和H2O2之間一種新的信號互作用現(xiàn)象。 7、H2O2對NO誘發(fā)的金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累的增效作用依賴于兩種信號分子之間的互催化反應(yīng)。DPI和PBITU不僅能夠抑制H2O2和NO之間的互催化反應(yīng),而且還能抑制H2O2對NO誘發(fā)黃酮類物質(zhì)合成積累的增效作用,表明H2O2對NO誘發(fā)黃酮類物質(zhì)合成積累的增效作用可能依賴于兩種信號分子之間的互催

10、化反應(yīng)。 8、NO和H2O2通過不同的機(jī)制介導(dǎo)UV-B誘發(fā)的金絲桃細(xì)胞中黃酮類物質(zhì)合成積累。UV-B可以誘導(dǎo)細(xì)胞中黃酮類次生物質(zhì)生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶CHS基因的表達(dá)上調(diào),NO淬滅劑cPTIO可以抑制UV-B誘發(fā)的CHS表達(dá),但H2O2淬滅劑CAT對UV-B誘發(fā)的CHS表達(dá)無影響,說明NO介導(dǎo)UV-B誘發(fā)黃酮類物質(zhì)合成積累與CHS基因的表達(dá)活化有關(guān),而H2O2介導(dǎo)的UV-B誘發(fā)黃酮類物質(zhì)合成積累與CHS基因的表達(dá)活化無關(guān)。因