聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度電泳技術(shù)(PCR-DGGE)研究中國白酒大典中微生物群落結(jié)構(gòu).pdf

1、酒曲釀造是我國優(yōu)勢傳統(tǒng)發(fā)酵食品白酒釀造的技術(shù)特征和關(guān)鍵技術(shù)。大曲以小麥等谷物為原料固態(tài)生料發(fā)酵而成,大曲作為白酒生產(chǎn)中微生物的主要來源,其質(zhì)量直接關(guān)系到酒的出酒率及酒質(zhì)。長期以來,由于研究技術(shù)手段的限制,對白酒大曲微生物區(qū)系的研究和認識還非常有限。
　　 為克服培養(yǎng)方法的局限性,采用建立在分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)上的未培養(yǎng)技術(shù),從未培養(yǎng)角度探究大曲微生物群落結(jié)構(gòu)組成對于深入白酒大曲微生物群落特征的認識,豐富我國傳統(tǒng)釀造食品微生物學(xué)的機

2、理的研究,具有實踐和理論意義和價值。
　　 本文運用PCR-DGGE方法對國內(nèi)具有代表性的不同工藝白酒大曲的微生物群落結(jié)構(gòu)進行了研究。分別基于細菌的16S rRNA V3基因、酵母的26S rRNA D1基因和真菌的18S rRNA基因?qū)Υ笄械募毦?、酵母和真菌的群落結(jié)構(gòu)進行了分析。通過DGGE優(yōu)勢條帶的切膠回收及測序鑒定獲取了大曲微生物種群結(jié)構(gòu)信息。
　　 研究結(jié)果表明:
　　 1)與傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法研究相比,

3、本研究首次基于細菌的16S rRNAV3基因DGGE揭示了白酒大曲中乳酸菌的種群多樣性,多種乳酸菌存在于不同工藝大曲中。所鑒定出的乳酸菌包括Weissella cibaria、Lactobacillus panis、L.helveticus、L.fermentum、L.pontis。細菌是中國大曲最具特點的微生物。同時DGGE檢測到了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法未檢測到的嗜麥芽窄食單胞菌、假單胞菌、葡萄球菌及高溫放線菌;
　　 2)在真菌的分析

4、研究中,針對傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和已報道未培養(yǎng)方法研究多集中在細菌群落結(jié)構(gòu)的狀況,分布基于酵母的26S rRNA D1基因和真菌的18S rRNA基因?qū)湍负驼婢郝浣Y(jié)構(gòu)進行了研究。酵母26S rRNA D1區(qū)基因的DGGE研究顯示Saccharomycopsis fibuligera、Pichia anomala普遍存在于所有大曲中,且在整個酵母群落中處于優(yōu)勢地位,彌補了傳統(tǒng)培養(yǎng)方法在反應(yīng)優(yōu)勢菌群分布方面的缺陷。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法研究認為大曲酵母群

5、落認為大曲中酵母主要為釀酒酵母、漢遜酵母、畢氏酵母、擬內(nèi)孢霉四大類酵母,本研究使用DGGE方法均檢測到了此四大類酵母,且還檢測到了Trichosporon asahii、Debaryomyces hansenii、Hanseniaspora guilliermondii等釀酒工業(yè)中認為重要的非釀酒酵母。犁頭霉及米根霉在真菌18S rRNA DGGE圖譜中顯示出明顯的優(yōu)勢地位。除犁頭霉、米曲霉及煙曲霉以外,利用18S rRNA引物還檢測到

6、了Candidatropicalis、Candida allociferrii、Saccharomyces bulderi等酵母。真菌18S rRNA DGGE圖譜Shannon-Wiener多樣性分析結(jié)果顯示單糧曲真菌多樣性均低于雜糧曲;
　　 3)地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌均為大曲中優(yōu)勢芽孢桿菌。PCR擴增的偏好性會引起細菌16S rRNA V3區(qū)引物很難將芽孢桿菌進行DGGE分離。通過利用巢式PCR獲取芽孢桿菌專一性基因,

7、將芽孢桿菌的16S rRNA V9區(qū)基因作為DGGE靶基因成功構(gòu)建了大曲芽孢桿菌群落結(jié)構(gòu)分析手段,該方法可較好的反應(yīng)不同工藝大曲中芽孢桿菌群落信息。
　　 4)為進一步研究工藝因素對大曲細菌群落組成影響,分析了同一產(chǎn)地5種高溫和中溫白酒大曲細菌群落結(jié)構(gòu)差異,通過優(yōu)勢條帶切膠鑒定,確定了大曲中優(yōu)勢細菌種屬信息。結(jié)果表明Weissella cibaria、L.helveticus、L.fermentum、L.panis等乳酸菌普遍存

8、在于5種大曲中,Thermoactinomyces sanguinis僅存在于高溫曲醬曲中。不同工藝大曲細菌群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異,隨著制曲溫度的升高,大曲細菌多樣性指數(shù)有下降趨勢。
　　 綜上,本研究從未培養(yǎng)角度較全面和系統(tǒng)地分析了不同工藝大曲微生物群落結(jié)構(gòu)組成,獲取了不同工藝大曲共有的優(yōu)勢種群信息,并研究了工藝因素對微生物種群結(jié)構(gòu)的影響。運用PCR-DGGE基因指紋圖譜技術(shù)分析白酒大曲的微生物群落結(jié)構(gòu),將其與傳統(tǒng)的菌種分離鑒定