纖維堆囊菌GSUV3-205發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素過(guò)程中關(guān)鍵因子的探索及優(yōu)化.pdf

1、粘細(xì)菌是一類(lèi)具有復(fù)雜多細(xì)胞社會(huì)學(xué)行為的革蘭氏陰性細(xì)菌，能夠合成多種具有抗腫瘤、抗真菌、抗細(xì)菌、免疫調(diào)節(jié)等生物活性的天然產(chǎn)物。研究人員已經(jīng)從粘細(xì)菌次級(jí)代謝物中鑒定出100多種基本化學(xué)結(jié)構(gòu)和500多種結(jié)構(gòu)類(lèi)似物。微生物來(lái)源的小分子物質(zhì)中約有3.5％來(lái)源于粘細(xì)菌，粘細(xì)菌代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的多樣性甚至可以與著名的鏈霉菌類(lèi)群和芽孢桿菌類(lèi)群相比擬。
　　 纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)屬于粘球菌目、堆囊菌亞

2、目、多囊菌科、堆囊菌屬，可以通過(guò)降解纖維素進(jìn)行生長(zhǎng)。據(jù)我們了解，纖維堆囊菌擁有迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的原核生物基因組，如纖維堆囊菌So ce56的基因組大小約為13Mb。目前研究結(jié)果顯示，在龐大的基因組中有大量基因被”奢侈”的用來(lái)進(jìn)行次級(jí)代謝，它合成的次級(jí)代謝產(chǎn)物幾乎占所有已發(fā)現(xiàn)粘細(xì)菌種類(lèi)的一半，并且?guī)缀?00％的菌株都具有合成生物學(xué)活性物質(zhì)的能力。因此，纖維堆囊菌不但具有重要的基礎(chǔ)研究?jī)r(jià)值，而且還具有誘人的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。
　　 埃

3、博霉素(epothilones)是粘細(xì)菌纖維堆囊菌(Sorangium cellulosum)產(chǎn)生的一類(lèi)聚酮類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物。與目前臨床上廣泛應(yīng)用的抗腫瘤化療藥物紫杉醇相比，它具有相似的穩(wěn)定微管活性，而且對(duì)紫杉醇耐藥的腫瘤細(xì)胞具有活性。目前至少有五個(gè)埃博霉素類(lèi)化合物(ixabepilone，patupilone，BMS-310705，KOS-862和ZK-EPO)已經(jīng)進(jìn)行了Ⅰ-Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)，而且目前已經(jīng)有一種產(chǎn)品(ixabepilone)

4、得到了美國(guó)FDA的權(quán)威認(rèn)證。但是，目前埃博霉素的發(fā)酵生產(chǎn)能力成為該藥研發(fā)的一個(gè)主要瓶頸。
　　 菌株GSUV3-205是本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)Genome Shuffling技術(shù)得到的一株具有較高產(chǎn)量的埃博霉素產(chǎn)生菌，具有一定的的工業(yè)應(yīng)用前景。但是無(wú)論是GSUV3-205還是在國(guó)際上其他實(shí)驗(yàn)室的發(fā)酵生產(chǎn)菌株，埃博霉素的實(shí)際生產(chǎn)量相對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)體系、底物利用率以及生物量都存在著轉(zhuǎn)化效率低的問(wèn)題，它們還是有很大的提升空間的。而且，通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的

5、傳代培養(yǎng)，重組菌株GSUV3-205的埃博霉素產(chǎn)生能力發(fā)生了很大的退化。因此，如何能夠在發(fā)酵體系中充分挖掘菌株的埃博霉素的合成能力成為研究者最為感興趣的問(wèn)題之一，所以對(duì)于纖維堆囊菌合成埃博霉素過(guò)程中某些關(guān)鍵因子的研究，對(duì)纖維堆囊菌資源的開(kāi)發(fā)利用和埃博霉素走向產(chǎn)業(yè)化都具有巨大的意義。
　　 本論文以本實(shí)驗(yàn)室的一株埃博霉素產(chǎn)生菌纖維堆囊菌GSUV3-205為研究材料，以提高菌株的埃博霉素合成能力為主要目標(biāo)，主要從菌株的培養(yǎng)條件、營(yíng)養(yǎng)

6、條件、生長(zhǎng)狀態(tài)等方面分別進(jìn)行了一系列系統(tǒng)的改進(jìn)和優(yōu)化，并取得了良好的結(jié)果。
　　 對(duì)于每一種能夠合成有應(yīng)用價(jià)值的代謝產(chǎn)物的微生物來(lái)說(shuō)，發(fā)酵過(guò)程改良都是從實(shí)驗(yàn)室理論研究走向工業(yè)產(chǎn)業(yè)化道路的必要階段，因此本文的研究工作首先分兩個(gè)階段分別對(duì)埃博霉素產(chǎn)生菌纖維堆囊菌GSUV3-205的發(fā)酵培養(yǎng)條件和營(yíng)養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。
　　 在第一階段，我們結(jié)合GSUV3-205的生理特性，主要對(duì)接種量、發(fā)酵時(shí)間、種子培養(yǎng)及接種的狀態(tài)、樹(shù)脂添加

7、時(shí)間、發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速等培養(yǎng)條件因素進(jìn)行了系列考察。根據(jù)不同接種量下的埃博霉素產(chǎn)生曲線(xiàn)，確定了合適的接種量(5×109個(gè)細(xì)胞/50ml)和發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間(9天)；通過(guò)對(duì)不同接種量時(shí)不同種子培養(yǎng)接種狀態(tài)的埃博霉素的產(chǎn)量進(jìn)行分析，確定了最優(yōu)的種子培養(yǎng)接種狀態(tài)(種子200rpm培養(yǎng)5天)；通過(guò)單因子分析樹(shù)脂添加時(shí)間和發(fā)酵培養(yǎng)轉(zhuǎn)速這兩個(gè)條件，得出了較有利于高產(chǎn)埃博霉素的條件，即滅菌時(shí)添加樹(shù)脂和200rpm發(fā)酵培養(yǎng)。
　　 第二個(gè)階段，我們利用

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)優(yōu)化方法中的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法以epothilone B的產(chǎn)量為響應(yīng)值對(duì)GSUV3-205生產(chǎn)埃博霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化。這個(gè)階段主要是通過(guò)兩個(gè)大的步驟來(lái)實(shí)現(xiàn)的。首先，我們?cè)谇捌谑褂玫腅PM培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上進(jìn)行了營(yíng)養(yǎng)成分的拓展和初步優(yōu)化，即：利用單因子實(shí)驗(yàn)考察了21種EPM培養(yǎng)基中不包含的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)epothilone B合成的影響，獲得了7種較有利于合成埃博霉素的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；然后利用Plackett-Burman和Box-Behn

9、ken響應(yīng)面設(shè)計(jì)把通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)拓展的7種營(yíng)養(yǎng)成分和EPM培養(yǎng)基中原有的所有成分進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)重要營(yíng)養(yǎng)成分的數(shù)學(xué)建模和響應(yīng)面分析，獲得了一個(gè)初步優(yōu)化的培養(yǎng)基。其成分是：糊精0.3％、蔗糖0.05％、葡萄糖0.08％、大豆粉0.17％、脫脂奶粉0.1％、七水硫酸鎂0.1％、無(wú)水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液2ml/L、微量元素液0.5ml/L、pH7.2、吸附樹(shù)脂2％(v/v)。可以看出，與EPM培養(yǎng)基相比(土豆淀粉0.2％、葡

10、萄糖0.2％、大豆粉0.2％、脫脂奶粉0.1％、七水硫酸鎂0.1％、無(wú)水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液1ml/L、微量元素液1ml/L、VB120.5mg/l、pII7.2、吸附樹(shù)脂2％(v/v))，優(yōu)化培養(yǎng)基中復(fù)雜碳源由土豆淀粉換成糊精且增加了添加量，同時(shí)增加了一個(gè)新的簡(jiǎn)單碳源即二糖物質(zhì)蔗糖，并對(duì)絕大部分成分的含量進(jìn)行了調(diào)整。利用這個(gè)培養(yǎng)基epothilone B的產(chǎn)量可以達(dá)到46.5mg/l，較原始產(chǎn)量11.3 mg/l提高

11、了3.1倍。此后，我們對(duì)初步優(yōu)化的培養(yǎng)基又進(jìn)行了進(jìn)一步的系統(tǒng)優(yōu)化：基于這個(gè)新的培養(yǎng)體系，利用FFD設(shè)計(jì)考察了這個(gè)體系各個(gè)組成成分對(duì)epothilone B產(chǎn)量的影響。發(fā)現(xiàn)三個(gè)因子糊精(X2)、脫脂奶粉(X6)和硫酸鎂(x8)對(duì)epothilone B的產(chǎn)量具有顯著性影響。利用CCD這種五水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法對(duì)這三個(gè)因素進(jìn)行了進(jìn)一步研究，建立了相應(yīng)的二次回歸模型：Y=51.69+17.03×X2+1.17×X6+0.70×X8-4.55×X

12、2×X2+7.01×X2×X6-2.48×X6×X6-0.69×X2×X8-2.01×X6×X8+0.52×X8×X8利用SAS8.0軟件的RSREG過(guò)程對(duì)這個(gè)模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義進(jìn)行分析，說(shuō)明了建立的數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)結(jié)果有好的相關(guān)性。通過(guò)模型可以看出糊精對(duì)于epothilone B的產(chǎn)量具有顯著影響，糊精和脫脂奶粉對(duì)epothilone B產(chǎn)量的影響具有較強(qiáng)的交互作用。最后獲得的優(yōu)化培養(yǎng)基成分為：糊精0.63％、蔗糖0.05％、葡萄糖0.0

13、8％、大豆粉0.17％、脫脂奶粉0.26％、七水硫酸鎂0.32％、無(wú)水氯化鈣0.1％、EDTA-Fe3+溶液2ml/L、微量元素液0.5ml/L、pH7.0、吸附樹(shù)脂2％(v/v)。So0157-2利用此培養(yǎng)體系發(fā)酵培養(yǎng)，可產(chǎn)生82.0mg/l的epothilone B，較初步優(yōu)化培養(yǎng)基(46.5mg/l)又提高了76.3％。這是首次在能夠產(chǎn)生埃博霉素的本源菌纖維堆囊菌中進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化，并把GSUV3-205的埃博霉素產(chǎn)量水平提

14、高到了較高的水平，為下一步開(kāi)展發(fā)酵罐中試和最終的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　 本文隨后的工作結(jié)合相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，將有可能與纖維堆囊菌發(fā)酵合成埃博霉素過(guò)程密切相關(guān)的小分子物質(zhì)，梯度添加到優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基中，探討了它們對(duì)GSUV3-205埃博霉素合成能力的影響。
　　 研究表明，鐵離子、甜菜堿類(lèi)物質(zhì)以及埃博霉素合成的前體物質(zhì)乙酸鹽、丙酸鹽、甲基丙二酸、琥珀酸、半胱氨酸等物質(zhì)的過(guò)量添加，都會(huì)對(duì)GSUV3-205合成埃博

15、霉素的過(guò)程有抑制作用。但是在適當(dāng)?shù)奶砑訒r(shí)間和添加量時(shí)，這些小分子物質(zhì)的存在會(huì)促進(jìn)GSUV3-205埃博霉素的合成。比如，在發(fā)酵第三天添加0.05％的98％的鹽酸甜菜堿時(shí)，埃博霉素產(chǎn)量有16％的提高；在添加10 mM的乙酸鈉、甲基丙二酸、半胱氨酸混合溶液時(shí)，epothilone A和B的產(chǎn)量分別提高了68％和270％。由此看見(jiàn)，這些小分子物質(zhì)的添加是與So0157-2的埃博霉素合成能力密切相關(guān)的。其中，我們首次將與epothilone B

16、合成的前體物質(zhì)甲基丙二酸單酰-CoA具有相同碳鏈骨架的甲基丙二酸添加到發(fā)酵培養(yǎng)中，并取得了良好的效果：在添加5 mM的甲基丙二酸時(shí)，epothilone B的產(chǎn)量比對(duì)照提高了86％。這些結(jié)果為進(jìn)一步利用連續(xù)或半連續(xù)發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行前體物質(zhì)添加提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也為GSUV3-205發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素的產(chǎn)物選擇提供了思路。
　　 GSUV3-205在液體培養(yǎng)基中聚團(tuán)生長(zhǎng)的特性成為該菌株大規(guī)模發(fā)酵及產(chǎn)業(yè)化道路上的重要障礙，同時(shí)這對(duì)于GSUV

17、3-205的某些性質(zhì)研究及遺傳操作方面來(lái)說(shuō)也是一個(gè)巨大的難題。我們希望通過(guò)生物學(xué)手段對(duì)GSUV3-205進(jìn)行性狀改造，在保持埃博霉素產(chǎn)生能力不變的情況下使其能夠在液體培養(yǎng)基中分散生長(zhǎng)。這樣一方面可以提高單位培養(yǎng)基中的生物量從而提高埃博霉素的單位產(chǎn)量，加快其工業(yè)化應(yīng)用的進(jìn)程，另一方面，還能夠給我們進(jìn)一步探索GSUV3-205的性質(zhì)及遺傳操作帶來(lái)極大的方便。
　　 因此我們從生物馴化和遺傳改造這兩個(gè)角度進(jìn)行了獲取GSUV3-205液

18、體分散生長(zhǎng)突變株的嘗試。通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的馴化流程對(duì)GSUV3-205進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的馴化培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)8個(gè)循環(huán)的馴化培養(yǎng)，我們最終得到了一株在M26液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀態(tài)有些分散的菌株GSUV3-205XH。盡管通過(guò)一系列的驗(yàn)證及分析發(fā)現(xiàn)，GSUHV3-205XH生長(zhǎng)非常緩慢而且?guī)缀鯖](méi)有埃博霉素產(chǎn)生能力，但是今后我們可以結(jié)合genome shuffling的思路方法利用這個(gè)菌株與埃博霉素高產(chǎn)菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合從而對(duì)菌株進(jìn)行育種改良，則有可能會(huì)得

19、到具有多重優(yōu)良性狀(分散生長(zhǎng)、代時(shí)短、合成次級(jí)代謝產(chǎn)物能力突出)的突變菌株。
　　 隨后，我們通過(guò)分析可能與GSUV3-205聚團(tuán)生長(zhǎng)密切相關(guān)的基因，選擇目前還沒(méi)有在纖維堆囊菌中進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究的pilA基因和epsD基因，通過(guò)克隆基因的同源片段構(gòu)建了pCCPA和pCCED兩種插入失活重組質(zhì)粒。通過(guò)使用添加抗生素的接合轉(zhuǎn)移體系，獲得了70株抗性接合菌株。此后我們對(duì)其進(jìn)行液體生長(zhǎng)狀態(tài)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些抗性菌株經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期培養(yǎng)并不能夠在液