Pseudomonas syringae致病變種的分子鑒定技術(shù)及其應(yīng)用.pdf

1、植物病原丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)根據(jù)其寄主植物以及所致病害的不同癥狀被分為許多致病變種(pathovar)。致病變種的鑒定是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，通常依據(jù)一系列復(fù)雜的理化特征等細(xì)菌學(xué)方法來鑒定。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，核酸雜交技術(shù)、基因組DNA指紋圖譜分析技術(shù)、保守基因以及特定基因的序列分析技術(shù)，為植物病原丁香假單胞菌基因組種團(tuán)(genomospecies)的劃分以及致病變種的鑒定提供了先進(jìn)方法。

2、r>　　 本研究通過分析16S rDNA、16S-23S ITS、hrp基因在丁香假單胞菌致病變種鑒定中的可能作用，并把分子鑒定結(jié)果與常規(guī)的細(xì)菌學(xué)鑒定結(jié)果相互驗(yàn)證，旨在篩選出適于丁香假單胞菌致病變種快速鑒定的指標(biāo)分子，建立一整套快速鑒定致病變種的分子鑒定技術(shù)體系。
　　 本研究所取得的主要結(jié)果如下：
　　 1．以來自8個丁香假單胞菌致病變種P. s．pv. tomato、 P. s． pv. angulata、 P.

3、s．pv. tabaci、P. s. pv. syringae、 P. s. pv. garcae,P. s. pv. glycinea、 P. s. pv. phaseolicola、P.s.pv. maculicola以及相關(guān)菌株P(guān). viridiflava、P.gingeri的共16個標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板，利用16SrDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度約為1560bp的特異性條帶，通過T/A克隆獲得含有目標(biāo)片段的重組質(zhì)

4、粒，經(jīng)測序得到了各致病變種16S rDNA基因的近全長序列。序列Blast同源性檢索以及序列系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示：植物假單胞病菌的16S rDNA序列高度保守，適于屬以及種水平上的鑒定。丁香假單胞菌的16S rDNA序列更為保守，16S rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，這一高度保守的16S rDNA基因不能滿足丁香假單胞菌致病變種分子鑒定的要求。
　　 2．利用16S-23S rDNA的保守序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增ITS全長序列的簡并引物

5、，以8個丁香假單胞菌致病變種的16個標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長度為750bp的特異性條帶。PCR產(chǎn)物分別經(jīng)限定性內(nèi)切酶HincⅡ及DdeⅠ酶切片段的RFLP分析表明，丁香假單胞菌的16S-23S ITS同樣高度保守，P. syringae8個致病變種的ITS擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP圖譜沒有足夠的多態(tài)性用來鑒別致病變種，僅有P. gingeri、P. viridiflava與P. syr ingae各致病變種的ITS-P

6、CR-RFLP圖譜明顯不同。因此，ITS序列同樣不是丁香假單胞菌致病變種分子鑒定的理想指標(biāo)。
　　 3．hrpZ基因是病原細(xì)菌所獨(dú)有的，其編碼產(chǎn)物既與致病性又與誘導(dǎo)非寄主的過敏性有關(guān)。利用設(shè)計(jì)的4對hrpZ基因引物，以丁香假單胞菌致病變種P. s．pv. tomato、P. s． pv. angulata、P.s.pv. tabaci、P.s. pv. syringae、 P. s. pv. garcae、 P. s.pv. g

7、lycinea、 P. s. pv. phaseolicola、P. s． pv. maculicola及其它相關(guān)供試菌株P(guān). viridiflava、P. gingeri的基因組DNA為PCR擴(kuò)增模板，分析了hrpZ基因的PCR擴(kuò)增片段長度多態(tài)性。結(jié)果表明，引物對HrpABF/R能夠有效區(qū)分全部8個供試丁香假單胞菌致病變種；引物對HrpZ08F/R1與HrpZ359/1115對于P. s．pv. garcae以及相關(guān)菌株無特異性擴(kuò)增結(jié)

8、果或者多態(tài)性結(jié)果。引物對HrpZ09UP/DW對供試菌株也有特異性或多態(tài)性擴(kuò)增結(jié)果，且在P. s． pv. syringae不同菌株之間存在條帶亮度差異。除引物對HrpABF/R外，引物對HrpZ08F/R、HrpZ09UP/DW與HrpZ359/1115都不能對P. s． pv. angulata和P. s． pv. tabaci進(jìn)行有效區(qū)分，說明了P. s．p v. angulata和P. s． pv. tabaci二者的hrpZ可

9、能相同。與16S rDNA以及ITS相比，hrpZ基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性在致病變種間非常豐富，而且致病變種內(nèi)的保守性強(qiáng)，擴(kuò)增結(jié)果清晰易辯。hrpZ基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析也表明了該基因是丁香假單胞菌致病變種快速鑒定的理想分子指標(biāo)。
　　 4．常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)菌形態(tài)特征、經(jīng)典LOPAT以及GATTa等一系列理化鑒定結(jié)果與基于hrpZ基因的分子鑒定結(jié)果相一致，但基于hrpZ的分子鑒定具有快速、準(zhǔn)確、易操作、結(jié)果客觀等獨(dú)特優(yōu)

10、勢，說明本研究成功建立了基于hrpZ基因的致病變種分子鑒定技術(shù)體系，為植物病原丁香假單胞菌及其致病變種的快速鑒定提供了一個有效策略。
　　 5．本研究中多次發(fā)現(xiàn)野火致病變種與角斑致病變種在形態(tài)學(xué)特性、理化特性、PCR擴(kuò)增特點(diǎn)等十分相似。為了區(qū)分二者，利用設(shè)計(jì)的引物對tabAF/R的特異性擴(kuò)增區(qū)分了P. s． pv. angulata和P. s． pv. tabaci兩個致病變種。結(jié)果表明野火致病變種P. s． pv. tabac

11、i能夠得到片段長度1263bp的特異性條帶，而角斑致病變種P. s． pv． angulata則沒有該特異性條帶。說明能夠利用特定基因(即煙毒素編碼基因)的擴(kuò)增策略能夠區(qū)分開tab+菌株和tab-菌株。
　　 6．利用本研究建立的基于hrpZ基因以及tabA基因的分子鑒定技術(shù)體系，成功地對豫西煙草細(xì)菌性葉斑病進(jìn)行了病原菌的快速鑒定，最終確定該細(xì)菌性葉斑病的病原為P. s． pv. tabaci的tab-菌株(即P. s． pv.