麥芽中酵母超前絮凝(PYF)活力新評價指標的建立與應(yīng)用研究.pdf

1、麥芽PYF（酵母超前絮凝）因子是麥芽中含有的某種可以影響酵母絮凝性能的多糖物質(zhì)，會在啤酒后熟期導(dǎo)致酵母發(fā)生提前絮凝(Premature Yeast Flocculation，PYF)現(xiàn)象，從而引發(fā)發(fā)酵不完全、成熟度差等嚴重質(zhì)量后果。
　　目前國內(nèi)外各大啤酒集團為了保證同一啤酒品牌多地生產(chǎn)的口味一致性，在麥芽采購方面均實行集中管理、統(tǒng)一采購，年進口采購量達百萬噸。如果一旦采購到有PYF問題的麥芽將直接影響到數(shù)十家啤酒廠的酵母生理狀態(tài)

2、及發(fā)酵過程的釀造性能，并最終對啤酒成品的風(fēng)味一致性產(chǎn)生極大的負面影響，隨之造成的經(jīng)濟損失及聲譽損失不可估量。
　　意識到這一問題的嚴重性后，啤酒制造企業(yè)也逐漸嘗試把麥芽PYF指標納進麥芽采購評價里，并根據(jù)各自酵母的絮凝敏感特性及生產(chǎn)質(zhì)量需求來設(shè)定麥芽PYF指標采購標準。然而目前通行的麥芽PYF活力評價方法都必須依賴酵母的絮凝表現(xiàn)來間接評價，其反映的是麥芽PYF活力、酵母絮凝性能以及活力狀態(tài)對酵母絮凝表現(xiàn)的一個綜合指標，缺乏客觀性而

3、不被麥芽制造商所認可;同時由于各啤酒集團使用的酵母菌種絮凝性差異非常大，依賴于各自菌種特性建立的麥芽PYF活力檢測方法各成體系，這也給把麥芽PYF指標納入采購標準帶來了一定的障礙。
　　因此本研究從對麥芽PYF多糖的提取純化著手，首次利用競爭ELISA檢測技術(shù)建立一種快速、靈敏、適應(yīng)于現(xiàn)場的麥芽PYF活力分析方法，該檢測方法及操作系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，可信度較高，有別于目前使用的PYF活力檢測方法需要利用酵母的特點，可轉(zhuǎn)化應(yīng)用為一種客觀

4、、適應(yīng)于第三方評估的麥芽大宗采購質(zhì)量評價指標;并通過對不同批次麥芽PYF活力的實際應(yīng)用檢測，對麥芽PYF的誘發(fā)機理與調(diào)控機制展開初步探索，形成一條從基礎(chǔ)到應(yīng)用的縱向研究體系。
　　主要研究成果如下:
　　(1)首先根據(jù)測定應(yīng)用酵母的絮凝特性分別從酵母懸浮液的初始濃度、緩沖體系的pH值、鈣離子濃度幾個方面對麥芽PYF微量光密度測定方法進行優(yōu)化改良，建立了一種快速、靈敏的適用于判定微量樣品麥芽PYF活力的方法，用以判定麥芽PYF

5、多糖各提純步驟的純化效率。
　　(2)依據(jù)麥芽PYF多糖是以極其松散的方式結(jié)合在酵母細胞壁之間、極易被洗脫的性質(zhì)特點，利用PYF強陽性麥芽進行發(fā)酵，然后以酵母泥為吸附基團，通過NaCl溶液對回收酵母的洗脫建立了一種快速、高效的麥芽PYF粗多糖提取方式。
　　利用切向流超濾技術(shù)對麥芽PYF多糖粗提液進行大幅度的濃縮、除鹽及小分子糖類的祛除，然后利用DEAE-Sephadex A-25離子交換樹脂及Sephadex G-100葡

6、聚糖凝膠柱層析等處理進行純化。
　　通過紫外吸收光譜掃描、SDS-PAGE試驗分析此種多糖含有蛋白結(jié)構(gòu)，分子量約為40kDa。但通過脫蛋白試驗表明蛋白成分不是引發(fā)PYF現(xiàn)象的必要組成部分。最后利用高效液相色譜技術(shù)鑒定證明得到了一種麥芽PYF純品，加入到酵母細胞中后能夠顯著的促進酵母的絮凝。
　　(3)分別以牛血清白蛋白(BSA)和匙孔血藍蛋白(KLH)為載體，采用高碘酸鈉法合成了麥芽PYF多糖的完全抗原，并利用紫外可見光譜掃

7、描方法證明完全抗原合成成功。
　　(4)利用PYF-BSA制備包被抗原，PYF-KLH制備免疫抗原，通過免疫Balb/c小鼠和新西蘭大白兔制備抗體，利用間接ELISA檢測兩種抗血清的效價分別可達1∶25600和1∶204800。并以兔多抗為基礎(chǔ)通過ELISA最佳反應(yīng)條件的建立、麥芽檢測樣品制備方法的優(yōu)化，初步建立了一套適用于實際麥芽樣品PYF多糖競爭ELISA分析方法的操作程序，其中競爭ELISA反應(yīng)體系的主要工作參數(shù)為:包被抗原

8、濃度為50μg/mL，兔抗血清稀釋度為10000倍，酶標二抗稀釋度為10000倍。
　　(5)從生產(chǎn)現(xiàn)場選取不同麥芽樣品分別利用競爭ELISA分析方法和原來使用的快速發(fā)酵法進行了重復(fù)性、重現(xiàn)性及靈敏度試驗的對比驗證，證明麥芽PYF因子競爭ELISA檢測方法其重復(fù)性及重現(xiàn)性遠遠大于快速發(fā)酵法，其變異系數(shù)分別小于5％和10％，說明該檢測方法及操作系統(tǒng)穩(wěn)定性較好，可信度較高。
　　(6)根據(jù)麥芽PYF值對本論文所選用酵母絮凝性能的

9、影響程度，建立以競爭ELISA法為依據(jù)的麥芽采購建議標準如下:
　　麥芽樣品OD450小于0.513的可判定為PYF強陽性麥芽，說明此批麥芽對酵母絮凝性能有較大影響，不予接受;
　　麥芽樣品OD450處于0.513～0.579之間的可判定為PYF弱陽性麥芽，說明此批麥芽對酵母絮凝性能有一定影響，可商定折價采購;
　　麥芽樣品OD450大于0.579的可判定為PYF陰性麥芽。
　　(7)綜合利用競爭ELISA法和快

10、速發(fā)酵法初步探討了麥芽搭配、洗麥、剝皮等降低麥芽PYF活力工藝措施的可行性。其中麥芽洗滌、原料除塵及剝皮可有效降低麥芽PYF活力，并充分證明了麥芽PYF多糖極易溶于水，且在水中保留了導(dǎo)致酵母產(chǎn)生PYF潛力的研究觀點。
　　同時發(fā)現(xiàn)麥芽PYF活力不具備簡單的加和性，因此進行麥芽搭配時，不能單純依靠計算理論值來判定搭配后的麥芽PYF活力，必須對配方麥芽重新進行PYF活力檢測;不同PYF強度的麥芽與PYF陰性麥芽搭配時，其對配方麥芽PY