產(chǎn)抗菌肽乳源乳酸菌的篩選及定向培養(yǎng).pdf

1、抗菌肽具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性好、抗菌機理獨特、抗菌譜廣等特點，且相對于抗生素具有高效、無殘留和不產(chǎn)生耐藥性等顯著優(yōu)點。乳源乳酸菌產(chǎn)生的抗菌肽是一種廣譜、高效、穩(wěn)定、安全的天然抗菌物質(zhì)，已成為當今國際研究的主要方向。目前抗菌肽主要應(yīng)用于奶牛乳房炎防治、治療仔豬腹瀉、促進肉雞生長、飼料添加、食品防腐等方面。國內(nèi)迄今尚未系統(tǒng)地對乳源乳酸菌進行抗菌肽篩選，也未確定高產(chǎn)抗菌肽的乳酸菌及培養(yǎng)方法。
　　 本研究根據(jù)抗菌肽作用機理，確定產(chǎn)抗

2、菌肽的乳源乳酸菌菌株，建立乳源乳酸菌高產(chǎn)抗菌肽定向培養(yǎng)技術(shù)，構(gòu)建高表達抗菌肽的乳酸菌培養(yǎng)新模式。并初步驗證了乳源乳酸菌產(chǎn)抗菌肽對原奶的抑菌作用，為抗菌肽的理論研究及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本實驗應(yīng)用牛津杯法，對德氏乳桿菌保加利亞亞種、瑞士乳桿菌、嗜酸乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌和乳酸乳球菌亞種進行分離、培養(yǎng)，篩選出抑菌活性強的菌種2種，分別為嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，并利用分離培養(yǎng)、鏡檢等常規(guī)方法以及16S rDNA分析、blast

3、分析和特異性引物PCR等技術(shù)對所選菌株進行鑒定。以抑菌效果作為評價指標，通過改變培養(yǎng)基營養(yǎng)成分及環(huán)境條件，確立乳酸乳源菌產(chǎn)抗菌肽的定向培養(yǎng)方法，然后通過正交實驗進行最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化。最后將抗菌肽產(chǎn)量明顯的菌株應(yīng)用于牛奶保鮮實驗，觀察評價其對牛奶保鮮的效果。試驗結(jié)果表明：①從7種乳源乳酸菌中篩選得出嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌具有較強的抑菌活性；②蛋白酶活性試驗說明抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)；③經(jīng)生理生化鑒定及特異性引物PCR分析確定為嗜酸乳桿菌

4、和干酪乳桿菌；④正交實驗測定結(jié)果表明，嗜酸乳桿菌最佳營養(yǎng)環(huán)境為：蔗糖3％、牛肉膏4％、NaCl0.5％、Tween-801.5％，起始pH為5.0；干酪乳桿菌最佳營養(yǎng)環(huán)境為：蔗糖1％、大豆蛋白胨3％、NaCl0.7％、Tween-801.0％，起始pH為6.0；⑤將嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌分別與大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進行共培養(yǎng)，經(jīng)24h、48h、72h、96h、120h作用后抑菌活性顯著提高，在培養(yǎng)120h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌幾

5、乎全部被抑制；⑥經(jīng)添加代謝前體物、調(diào)節(jié)起始pH、培養(yǎng)溫度及拮抗作用等定向培養(yǎng)方式嗜酸乳桿菌抑菌直徑達到23.53±0.06mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)抑菌直徑11.63±0.15mm的相比抑菌活性提高了約102％；經(jīng)定向培養(yǎng)的干酪乳桿菌抑菌直徑達到21.27±0.25mm，與未經(jīng)定向培養(yǎng)抑菌直徑12.50±0.10mm的相比抑菌活性提高了70.2％；⑦將抗菌肽添加到原奶中，在4℃和25℃下都能有效地抑制牛奶中細菌生長及酸化。以上試驗研究結(jié)果表明