胸膜肺炎放線桿菌N-乙酰葡糖胺-1磷酸尿苷酰轉移酶的表達及抑制劑篩選.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起的,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴重經(jīng)濟損失。UDP-乙酰葡萄糖胺(UDP-N-acetylglucosamine,UDP-GlcNAc)是病原菌細胞壁碳水化合物合成的必須前體,如肽聚糖、脂質A、磷壁酸等,由雙功能酶N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸尿苷酰轉移酶

2、(N-acetylglucosamine-1-phosphateuridyltransferase,GlmU)催化1-磷酸葡萄糖胺(glucosamine-1—phosphate,GlcN-1-P)、乙酰輔酶A和UTP經(jīng)過兩步反應生成。如果干擾UDP-GlcNAc合成路徑將嚴重阻礙細菌的生長并影響其毒力,因此GlmU是一個重要的藥物靶標。為了對GlmU先導化合物活性進行研究,對GlmU蛋白的酶促動力學分析是非常必要的。本論文主要對胸膜肺

3、炎放線桿菌GlmU蛋白進行了研究,主要成果如下:
　　 1.glmU基因的克隆表達與純化
　　 根據(jù)NCBI Genebank中提供的胸膜肺炎放線桿菌血清3型JL03菌株全基因組序列設計引物。以胸膜肺炎放線桿菌JL03基因組為模板,采用PCR方法擴增了glmU基因,將其克隆到了pET-28a表達載體上,并在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中進行了高效表達,對表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE和Western blot分析,結果表

4、明重組蛋白與預期分子量大小一致(50 KD),該蛋白的成功純化為下一步的研究奠定了良好基礎。
　　 2.GlmU尿苷酰轉移酶酶促動力學分析
　　 采用孔雀石綠鉬酸銨顯色法測定了GlmU尿苷酰轉移酶的初速度,確定了其最佳陽離子表面活性劑是聚乙烯醇(PVA),最佳檢測波長為630 nm,最佳反應溫度為37℃,最佳反應時間為5 min,最佳反應pH值為7.6,并在最佳反應條件下測定了其酶促動力學常數(shù):對于底物GlcNAc-1-

5、P,GlmU的Km值為0.05478 mM,最大速率Vmax為0.00370 mM min-1,對于底物UTP,GlmU的Km值為0.06608 mM,最大速率Vmax為0.00371 mM min-1。
　　 3.GlmU抑制劑的初步篩選
　　 運用上述酶活測定體系評估了計算機虛擬篩選的44個先導化合物,得到了8個效果較好的抑制劑,分別對這8個先導化合物進行了抑制常數(shù)和IC50的測定,為進一步研究其抑制作用機理和研制新