海洋黑曲霉生產(chǎn)耐鹽型纖維素酶和β-葡糖苷酶及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、纖維素酶是將纖維素降解為葡萄糖的酶，由內(nèi)切酶、外切酶和β-葡糖苷酶組成。β-葡糖苷酶將纖維二糖降解為葡萄糖，是酶解纖維素過程中的關(guān)鍵步驟之一。耐鹽纖維素酶可以在高鹽環(huán)境下高效降解纖維素，造紙和纖維素預(yù)處理廢水的治理，海洋垃圾、海藻和海草中纖維素的高效利用，鹽堿地的修復(fù)等需要耐鹽的纖維素酶。
　　 本論文從海洋中篩選產(chǎn)耐鹽纖維素酶的菌株，通過對具有良好耐鹽性能的纖維素酶和β-葡糖苷酶的發(fā)酵工藝、酶學(xué)性質(zhì)、普遍的耐鹽機(jī)制等的研究，為

2、高鹽環(huán)境中纖維素的降解打下基礎(chǔ)。論文研究包括以下內(nèi)容:
　　 首先，從海洋中篩選得到產(chǎn)耐鹽纖維素酶的真菌，根據(jù)該真菌的形態(tài)，ITS序列和5％ NaCl(w/v)最適生長鹽度，鑒定該真菌為嗜鹽海洋黑曲霉。海洋黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶最適溫度和pH為58℃和4.5，在12％ NaCl(w/v)溶液中的酶活最大，是在無NaCl溶液中酶活的1.33倍。該纖維素酶在黑液廢水中降解纖維素，降解12h產(chǎn)生的葡萄糖比在自來水中降解纖維素產(chǎn)生的葡萄糖

3、多了11.5％。研究結(jié)果表明，海洋黑曲霉產(chǎn)生的纖維素酶是一種具有良好耐鹽耐熱性能的纖維素酶。
　　 其次，研究了纖維素酶的固體發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)了纖維素酶的環(huán)境友好型生產(chǎn)。固體發(fā)酵的天然培養(yǎng)基最優(yōu)組成為:76.9％水葫蘆(w/w)，8.9％玉米芯(w/w)，3.5％稻草粉(w/w)，10.7％麩皮(w/w)和干固體基質(zhì)2.33倍的天然海水。天然海水中的主要無機(jī)鹽都能增加纖維素酶的產(chǎn)量。發(fā)酵144 h，纖維素酶的酶活達(dá)到17.80 U

4、/g干固體基質(zhì)。
　　 第三，研究了液體發(fā)酵時海洋黑曲霉纖維素酶酶活和胞外蛋白表達(dá)對不同碳源的響應(yīng)。海洋黑曲霉纖維素酶的酶活和胞外蛋白對不同碳源的響應(yīng)有較大差異。在以玉米芯或稻草稈作為碳源時，液體發(fā)酵產(chǎn)生的內(nèi)切酶、β-葡糖苷酶和纖維素酶的酶活分別為2.00 U/mL和1.70 U/mL、3.25 U/mL和2.62 U/mL、0.13和0.08 U/mL，比活力分別為1.39 U/mg蛋白和1.31 U/mg蛋白，3.25 U/

5、mg蛋白和2.62 U/mg蛋白，0.181 U/mg蛋白和0.165 U/mg蛋白。二維電泳分析表明，以玉米芯或稻草稈作為碳源時，海洋黑曲霉產(chǎn)生的胞外蛋白的種類差異達(dá)到15種。
　　 第四，用絲瓜囊作為固定化載體固定海洋黑曲霉，連續(xù)批次發(fā)酵生產(chǎn)β-葡糖苷酶。絲瓜囊固定的菌絲量達(dá)到3.1 g/L，固定效率達(dá)到95％以上。固定化發(fā)酵縮短了發(fā)酵周期，達(dá)到最大產(chǎn)量的時間由游離發(fā)酵的7d降為固定化發(fā)酵的4.5 d。固定化發(fā)酵的第3、4批

6、次的產(chǎn)量高于游離發(fā)酵的產(chǎn)量，固定化連續(xù)5批次發(fā)酵的β-葡糖苷酶產(chǎn)量均高于110 U/mL。
　　 第五，研究了β-葡糖苷酶在不同鹽度下的酶學(xué)性質(zhì)和熱失活動力學(xué)。粗β-葡糖苷酶在6％ NaCl(w/v)溶液中的酶活最高。在0％和6％ NaCl(w/v)溶液中的最適溫度和pH相同，都為66℃和5.0。在6％ NaCl(w/v)溶液中的酶活是在無NaCl溶液中的1.46倍。在62℃，65℃，67℃和70℃，β-葡糖苷酶在6％NaCl(

7、w/v)溶液中的半衰期均高于在無NaCl溶液中半衰期的2倍以上。β-葡糖苷酶在6％ NaCl(w/v)溶液中的熱失活自由能比在無NaCl溶液中的熱失活自由能和熔點(diǎn)溫度分別高了約2 kJ/mol，熔點(diǎn)溫度也略微提高。純化后測得β-葡糖苷酶的分子量約為110 kDa。在高鹽度環(huán)境下，純β-葡糖苷酶的酶活和半衰期的增長與粗β-葡糖苷酶酶活和半衰期的增長相似。研究結(jié)果表明該海洋黑曲霉產(chǎn)生的β-葡糖苷酶是耐鹽耐熱型β-葡糖苷酶。
　　 第

8、六，構(gòu)建了β-葡糖苷酶的分子模型，探討了該類酶的耐鹽機(jī)制。建立了該類酶的分子模型，大量的谷氨酸和天冬氨酸殘基分布在分子模型表面。在分子表面的大量酸性氨基酸殘基賦予β-葡糖苷酶高負(fù)離子型表面，高負(fù)離子型表面和分子內(nèi)核的作用可能增強(qiáng)了β-葡糖苷酶在高鹽環(huán)境下的熱穩(wěn)定性。β-葡糖苷酶在高鹽度下活性增加的原因可能是高鹽的環(huán)境使β-葡糖苷酶異構(gòu)化，異構(gòu)體的催化位點(diǎn)更容易與底物纖維素二糖作用。
　　 本論文對耐鹽纖維素酶和β-葡糖苷酶的高效