殼寡糖對(duì)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)生物分子動(dòng)態(tài)變化的影響.pdf

1、殼聚糖是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物,由2-氨基-2-脫氧-β-D-葡萄糖聚合構(gòu)成,生物學(xué)功能豐富,已有研究表明殼聚糖及其降解產(chǎn)物殼寡糖可以有效地抑制大腸桿菌的生長(zhǎng),且具有無(wú)毒、易降解、生物相容性等優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用前景廣闊。目前,關(guān)于殼聚糖及殼寡糖對(duì)微生物的抑制規(guī)律已有大量的研究報(bào)道,其中包括殼聚糖會(huì)破壞微生物的細(xì)胞膜的滲透性,會(huì)引起微生物胞內(nèi)活性氧的含量增加等,但關(guān)于其抑菌機(jī)理方面的認(rèn)識(shí)不足。本論文采用生物化學(xué)分析和蛋白質(zhì)組學(xué)的方法,開(kāi)展了殼寡糖在

2、抑制大腸桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中引起的生物分子動(dòng)態(tài)變化的研究,結(jié)果如下。
　　利用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定殼寡糖處理對(duì)大腸桿菌生長(zhǎng)的抑制效果,結(jié)果表明在0.5％殼寡糖的作用下,活菌數(shù)表現(xiàn)為先減少后增多,而1%殼寡糖的處理使活菌數(shù)逐漸減少,抑菌效果明顯。通過(guò)檢測(cè)胞內(nèi)堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶和β-半乳糖苷酶的外泄情況得出在0.5%和1%殼寡糖的作用下,大腸桿菌的菌體完整性遭到了一定程度的破壞。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了大腸桿菌的凋亡情況:大腸桿菌在培養(yǎng)2h、4h

3、和6h的情況下,細(xì)胞凋亡程度逐漸增強(qiáng),而壞死程度基本穩(wěn)定。綜合分析大腸桿菌凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果、活菌數(shù)結(jié)果及菌體完整性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,表明大腸桿菌的生長(zhǎng)在受到殼寡糖影響時(shí)表現(xiàn)為壞死程度相對(duì)穩(wěn)定而凋亡程度不斷增加,說(shuō)明殼寡糖可能主要是通過(guò)誘導(dǎo)大腸桿菌發(fā)生凋亡來(lái)發(fā)揮抑菌作用的。
　　大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖的處理下,胞內(nèi)活性氧濃度快速升高,隨后逐漸降低,1%殼寡糖處理組變化趨勢(shì)較0.5%殼寡糖處理組明顯,而且在相同的時(shí)間下1%殼寡糖處理組活

4、性氧的相對(duì)含量高于0.5%殼寡糖處理組。在氧化性損傷的測(cè)定中,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,膜質(zhì)的氧化損傷,蛋白質(zhì)的氧化損傷嚴(yán)重,丙二醛含量、蛋白質(zhì)羰基化和硝基化含量明顯高于對(duì)照組,0.5%殼寡糖處理的大腸桿菌在0-4 h內(nèi)丙二醛含量、蛋白質(zhì)羰基化和硝基化含量逐漸增加,而在4-16 h其含量逐漸減少。1%殼寡糖處理的大腸桿菌隨著時(shí)間的延長(zhǎng)膜質(zhì)和蛋白質(zhì)氧化損傷逐漸增強(qiáng)。而DNA氧化損傷,在0.5%和1%殼寡糖的處理下,8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷的

5、含量在2h和4h與對(duì)照組有明顯差異外,在其他時(shí)間內(nèi)DNA氧化損傷作用不明顯。上述結(jié)果表明殼寡糖處理可能通過(guò)誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧濃度增加和積累進(jìn)而導(dǎo)致生物分子的氧化損傷,影響大腸桿菌的生長(zhǎng)。
　　利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)檢測(cè)了殼寡糖處理后大腸桿菌胞內(nèi)蛋白質(zhì)表達(dá)的差異情況。大腸桿菌在0.5%和1%殼寡糖處理下培養(yǎng)4 h,提取的大腸桿菌總蛋白經(jīng)雙向電泳分離,綜合處理組與對(duì)照組蛋白點(diǎn)的差異與不同,共分離得到1150個(gè)蛋白點(diǎn),對(duì)蛋白質(zhì)的2-D電泳圖譜進(jìn)

6、行比對(duì)分析,選擇2倍差異變化的蛋白點(diǎn)作為分析對(duì)象,結(jié)合膠上蛋白點(diǎn)的實(shí)際情況對(duì)其中的42個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定,成功鑒定出40個(gè)蛋白點(diǎn),這些蛋白點(diǎn)屬于35種蛋白質(zhì),殼寡糖處理組與對(duì)照組相比有28個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量上調(diào),有10個(gè)蛋白點(diǎn)表達(dá)量下調(diào),有2個(gè)特殊點(diǎn)在0.5%殼寡糖處理組與1%殼寡糖處理組和對(duì)照組之間呈現(xiàn)不同。為了進(jìn)一步了解差異表達(dá)蛋白的功能,鑒定得到的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能聚類分析,結(jié)果表明上述蛋白主要參與物質(zhì)代謝、蛋白質(zhì)合成和氧化還原等。