新型P2Y樣G蛋白偶聯(lián)受體GPR17在缺血性腦損傷中的作用.pdf

1、研究背景：
　　 腦缺血再灌注損傷是高度復(fù)雜的病理過程，腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥是腦缺血后病變的主要特點(diǎn)。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要的炎癥細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活對(duì)于缺血后炎癥進(jìn)程以及慢性神經(jīng)功能的恢復(fù)具有重要的影響。腺嘌呤核苷酸(ATP、ADP)、尿嘧啶核苷酸(UTP、UDP)、糖基化核苷酸(UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)等細(xì)胞外核苷酸以及半胱氨酰白三烯(cysteinylleukotrienes，CysLTs，包括L

2、TC4、LTD4和LTE4)是兩類重要的細(xì)胞外信號(hào)分子，能夠交叉調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥，其中包括腦缺血。
　　 GPR17原是一種G蛋白偶聯(lián)的孤兒受體(orphanreceptor)，在2006年被鑒定出來，在分子進(jìn)化上與P2Y核苷酸受體和半胱氨酰白三烯受體均有交叉，是一種新型P2Y樣受體。GPR17是一個(gè)“二元受體”，半胱氨酰白三烯(LTC4、LTD4)及尿嘧啶核苷酸(UDP、UDP-葡萄糖、UDP-半乳糖)均能激活GPR17

3、；但GPR17是否能歸類在白三烯受體，目前還不夠成熟。
　　 GPR17主要分布在腦內(nèi)，其次為腎臟、心臟和血管內(nèi)皮細(xì)胞，目前對(duì)GPR17的效應(yīng)了解較少，正常時(shí)GPR17表達(dá)在腦、脊髓神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)GPR17。GPR17能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的發(fā)育成熟，是髓鞘形成的細(xì)胞內(nèi)計(jì)時(shí)器。GPR17是腦和脊髓損傷的感受器，免疫染色結(jié)果顯示損傷急性期GPR17表達(dá)升高，而用反義寡核苷酸手段敲低

4、GPR17的表達(dá)能夠控制急性永久性腦缺血損傷以及脊髓損傷的進(jìn)展；然而，因缺乏GPR17選擇性拮抗劑和動(dòng)物特異性抗體，GPR17是否參與腦缺血后神經(jīng)元損傷、小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，以及是否對(duì)慢性腦缺血損傷也具有調(diào)節(jié)作用，尚待闡明。
　　 研究目的：
　　 本文擬觀察新型P2Y樣G蛋白偶聯(lián)受體GPR17對(duì)腦缺血誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷及小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響，做以下2個(gè)方面的研究：
　　 (1)觀察大鼠局灶性腦缺血后腦內(nèi)GPR17的

5、時(shí)空表達(dá)特征及細(xì)胞定位，并干擾腦內(nèi)GPR17表達(dá)，觀察對(duì)腦缺血急、慢性期神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響；
　　 (2)以RNA干擾技術(shù)，研究GPR17對(duì)OGD誘導(dǎo)的皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)中神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。
　　 研究方法：
　　 以線栓法制備大鼠局灶性腦缺血(MCAO)模型。采用免疫組織化學(xué)、免疫印跡、RT-PCR等方法，觀察腦內(nèi)GPR17表達(dá)的時(shí)空特點(diǎn)，免疫熒光雙染觀察受體在腦內(nèi)的分布。大鼠側(cè)腦室

6、埋管，注射GPR17siRNA，靶向沉默腦內(nèi)GPR17表達(dá)，觀察對(duì)大鼠局灶性腦缺血急、慢性期神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。
　　 在大鼠皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中，以缺氧缺糖(OGD)誘導(dǎo)缺血性損傷，以GPR17siRNA靶向沉默混合培養(yǎng)體系中GPR17的表達(dá)，觀察對(duì)OGD誘導(dǎo)的原代皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)體系中神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 第一部分大鼠局灶性腦缺血后腦內(nèi)新型P2Y樣G蛋白偶

7、聯(lián)受體GPR17表達(dá)增加介導(dǎo)神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活
　　 大鼠MCAO后缺血中心區(qū)，GPR17蛋白在缺血再灌注12、24h和7、14d表達(dá)上調(diào)；缺血周邊區(qū)，再灌注3d內(nèi)GPR17蛋白表達(dá)變化不大，而在再灌注7、14d明顯增高。與Westernblot結(jié)果相一致，RT-PCR的結(jié)果顯示在缺血后中心區(qū)，GPR17mRNA在缺血再灌注24h和7、14d表達(dá)上調(diào)；缺血周邊區(qū)，再灌注24h、3、14d明顯增高。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示GP

8、R17陽性細(xì)胞數(shù)在缺血后中心區(qū)和周邊區(qū)增多。免疫熒光結(jié)果顯示，正常大鼠腦組織中，GPR17主要表達(dá)于神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞，室管膜細(xì)胞。MCAO后，在缺血中心區(qū)，再灌注24h后GPR17主要表達(dá)于損傷的神經(jīng)元，少量表達(dá)于損傷的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，再灌注14dGPR17主要表達(dá)于增生激活的小膠質(zhì)細(xì)胞，部分表達(dá)于少突膠質(zhì)細(xì)胞；在缺血周邊區(qū)，再灌注24h后GPR17主要表達(dá)于神經(jīng)元，少量表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞，再灌注14d后GPR

9、17主要表達(dá)于神經(jīng)元、部分增生的小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)GPR17。
　　 經(jīng)Westernblot及免疫熒光染色證實(shí)，大鼠側(cè)腦室給予GPR17siRNA成功抑制缺血后腦內(nèi)GPR17表達(dá)。GPR17siRNA給藥后能顯著減輕缺血再灌注24h神經(jīng)癥狀、減少腦梗死體積以及改善缺血中心區(qū)的神經(jīng)元缺失；同樣，它也改善缺血再灌注14d腦萎縮和缺血周邊區(qū)的神經(jīng)元缺失，還顯著抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的增生激活。
　　 這些結(jié)

10、果證實(shí)，缺血后腦內(nèi)GPR17表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)腦缺血后急性期神經(jīng)元損傷和亞急性/慢性期小膠質(zhì)細(xì)胞增生和炎癥。
　　 第二部分GPR17干擾對(duì)OGD誘導(dǎo)的皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)中神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活的影響
　　 大鼠原代皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)中，經(jīng)Westernblot及免疫熒光染色證實(shí)，GPR17siRNA成功抑制GPR17表達(dá)。OGD/R(OGD1h恢復(fù)24h)誘導(dǎo)細(xì)胞活性下降，LDH釋放增加，PI染色結(jié)果顯示細(xì)胞壞死增加。GP

11、R17siRNA抑制OGD/R誘導(dǎo)的LDH釋放，提高細(xì)胞活性，并減少細(xì)胞壞死數(shù)目。并且，免疫熒光雙染結(jié)果顯示，細(xì)胞死亡以神經(jīng)元死亡為主，少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞死亡較少，GPR17siRNA主要減少神經(jīng)元死亡。免疫熒光染色結(jié)果還顯示，GPR17siRNA能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活的形態(tài)變化。免疫熒光以及Westernblot結(jié)果顯示，敲低GPR17表達(dá)后CysLT1受體表達(dá)增加。
　　 上述結(jié)果提示，GPR17介導(dǎo)皮層

12、細(xì)胞混合培養(yǎng)中OGD誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。并且，GPR17與CysLT1受體亞型之間可能存在著相互調(diào)節(jié)。
　　 結(jié)論：
　　 1.在大鼠局灶性腦缺血后，腦內(nèi)GPR17表達(dá)的時(shí)空分布特點(diǎn)以及GPR17siRNA干擾的結(jié)果表明，缺血后腦內(nèi)GPR17表達(dá)上調(diào)，介導(dǎo)缺血后急性神經(jīng)元損傷以及亞急性/慢性期的小膠質(zhì)細(xì)胞激活。
　　 2.在大鼠皮層細(xì)胞混合培養(yǎng)中，GPR17RNA干擾的結(jié)果表明，GPR17介導(dǎo)OGD